ALK陽性非小細胞肺癌72例臨床病理分析

曹培龍，王 凱，王鴻雁，張冠軍，王春寶，蔣 娜，趙 熒

ALK陽性非小細胞肺癌72例臨床病理分析

曹培龍，王 凱，王鴻雁，張冠軍，王春寶，蔣 娜，趙 熒

目的探討非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)伴間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)蛋白陽性患者的臨床病理學特征。方法應用Ventana抗ALK試劑和全自動免疫組化染色檢測1 047例NSCLC組織中ALK的表達，并對其中142例進行RT-PCR檢測。結果1 047例NSCLC中，共篩出72例ALK陽性，占(6.88%)；其中腺癌70例，腺鱗癌2例，男性40例，女性32例，中位年齡56歲，平均年齡55.60歲，37例有吸煙史，35例無吸煙史。組織形態學方面，43例以實性為主型，16例以腺泡樣為主型，13例以乳頭狀為主型，無以附壁樣為主型病例。結論ALK基因融合肺癌是NSCLC中的一種新的分子亞型，具有獨特的臨床表現和病理形態；Ventana抗ALK試劑和免疫組化染色是檢測ALK陽性NSCLC的首選方法，對提高該類型肺癌的檢出率及個體化治療具有重要意義。

肺腫瘤；非小細胞肺癌；間變性淋巴瘤激酶；免疫組織化學

全球范圍內肺癌的發病率和病死率均較高，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)最為常見，約占肺癌的80%[1]。隨著分子醫學的進展和靶向藥物的不斷涌現，晚期NSCLC的治療已進入到個體化治療時代。目前以表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor, EGFR)基因突變為靶點的新型小分子酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)如吉非替尼、厄洛替尼等，在晚期NSCLC的治療上，已取得較好的臨床效果[2-3]。隨之研究發現棘皮動物微管相關蛋白樣4(echinoderm microtubule associated protein-like 4, EML4)與間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)融合基因EML4-ALK是肺癌的驅動基因[4]。臨床研究顯示，ALK酪氨酸激酶抑制劑克唑替尼(crizotinib)對EML4-ALK融合基因陽性患者的療效顯著[3]，2011年美國食品藥品管理局(FDA)和2013年我國食品藥品監督管理局(CFDA)先后批準克唑替尼用于治療局部晚期或轉移性ALK陽性NSCLC患者。因此，通過晚期NSCLC患者ALK狀態的檢測，找出適合接受針對這一靶向治療的患者已成為臨床和病理醫師的共同目標。本實驗收集1 047例NSCLC樣本，采用Ventana抗ALK試劑和全自動免疫組化染色，部分病例同時行RT-PCR檢測，探討其臨床病理學特征。

1 材料與方法

1.1一般資料收集2012年4月～2015年12月西安交通大學第一附屬醫院存檔的NSCLC石蠟包埋組織1 047份(鱗狀細胞癌93例，腺癌952例，腺鱗癌2例)，其中包括手術切除肺葉、經皮肺穿刺、轉移病灶的標本，獲取其臨床信息如年齡、性別、吸煙史、病理分型、原發部位、臨床分期、EGFR基因突變檢測結果等，通過電話隨訪患者本人或家屬獲取預后資料。

1.2方法

1.2.1標本處理 標本經10%中性福爾馬林固定，脫水，石蠟包埋，4 μm厚切片，行HE染色。

1.2.2ALK蛋白免疫組化染色 ALK(D5F3)即用型兔單克隆抗體和OptiView DAB免疫組化檢測試劑盒以及擴增試劑盒購自Roche Diagnostics GmbH公司，在Ventana BenchMark XT全自動免疫組化染色儀上進行檢測，染色方法按Ventana全自動免疫組化染色儀操作流程進行(EnVision法)，均有陰性和陽性細胞系對照。采用二元判別法，即ALK陽性表達判斷標準：無論著色細胞多少，只要有腫瘤細胞胞質內出現強染色顆粒，即判定為陽性[4]，反之為陰性。

1.2.3RT-PCR檢測 采用Qiagen純化試劑盒提取、純化石蠟組織中的RNA，用人類EML4-ALK融合基因檢測試劑盒(熒光PCR法，深圳艾德生物公司)，檢測9種融合基因突變。

1.2.4EGFR基因突變檢測 采用Qiagen DNA Kit石蠟包埋組織DNA提取試劑盒，抽提樣本中的DNA；采用ARMS法檢測EGFR基因的29種突變狀態；操作嚴格按照試劑盒(深圳艾德生物公司)說明書進行。

1.3統計學分析采用SPSS 18.0軟件進行統計學處理。組間率的比較用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1ALK陽性NSCLC的臨床特征本組1 047例NSCLC組織中，共篩選出72例ALK陽性病例，檢出率為6.88%。72例ALK陽性肺癌患者中，男性40例，占55.56%，女性32例，占44.44%，男性患者例數略多于女性。年齡25～85歲，中位年齡56歲，平均(55.60±11.49)歲。42例(58.30%)患者年齡<60歲，30例(41.60%)患者年齡≥60歲，在本組病例中年齡<60歲者數量多于年齡≥60歲者。其中年齡<60歲的女性有27例，占女性患者的64.28%(27/42)，男性15例，占男性患者的35.71%(15/42)，顯示年齡<60歲ALK陽性的NSCLC患者中女性患者多于男性患者，差異有統計學意義(χ2=16.07，P<0.01)。本組72例肺癌患者，男性患者37例有吸煙史，僅3例無吸煙史，女性患者32例，均無吸煙史。發生于右肺者43例，占59.72%(43/72)，發生于左肺者29例，占40.28%(29/72)，右肺發病高于左肺。初發為轉移病灶6例，占8.33%(6/72)，其中頸部淋巴結及纖維組織內轉移5例，骨轉移1例，后均被肺部活檢證實，EGFR檢測均為野生型，未行ALK融合基因檢測。本組患者病理組織學分級：Ⅰ級1例，Ⅱ級17例，Ⅲ級54例；臨床分期：Ⅰ期1例，Ⅱ期14例，Ⅲ期21例，Ⅳ期36例。提示ALK陽性NSCLC患者發現時大多病理組織學顯示分化程度較低，且處于中、晚期的患者數量多。

2.2ALK陽性NSCLC的病理形態學特征本組72例NSCLC中腺癌70例，占97.22%，腺鱗癌2例，占2.78%，陽性部位為腺癌成分，無單純鱗狀細胞癌病例。其中41例以實性為主型，占58.57%(41/70)，癌細胞呈大小不等巢團狀排列，大部分胞質較豐富，嗜酸性，類似鱗狀細胞癌，但核膜薄、均一，細胞核染色質細或呈空泡狀，可見明顯核仁。本組中有20例呈現一種細胞黏附性差的改變，細胞呈多邊形，胞質豐富細顆粒狀或泡沫狀，核居中或偏位似橫紋肌樣細胞(圖1)。實性為主型中有7例合并黏液產生，3例以印戒細胞癌樣為主。16例以腺泡樣為主型，占22.86%(16/70)，表現為含大量腺體成分，細胞圓形或卵圓形，圍繞中央空腔排列或呈篩狀排列(圖2)。腺泡樣為主型中8例伴有明顯黏液分泌。13例以乳頭狀為主型，占18.57%(13/70)，該型腺癌顯示其主要成分為沿中心纖維血管軸心生長的腺癌細胞，部分區可出現附壁樣生長，但肺泡腔內有乳頭狀結構(圖3)，乳頭為主型中有4例伴有黏液分泌。本組ALK陽性NSCLC患者中無以附壁樣為主型病例，以實性為主型所占比例最大。三組不同組織形態學患者病死率之間差異無顯著性(χ2=2.761，P>0.05)。

圖1A.細胞多邊形，胞質豐富細顆粒狀或泡沫狀，核居中或偏位似橫紋肌樣細胞；B.實性型非小細胞肺癌ALK陽性，EnVision法圖2A.細胞圓形或卵圓形，圍繞中央空腔排列或呈篩狀排列；B.腺泡型非小細胞肺癌ALK陽性，EnVision法圖3A.細胞沿中心纖維血管軸心生長，部分區可出現伏壁樣生長，肺泡腔內有乳頭狀結構；B.乳頭型非小細胞肺癌ALK陽性，EnVision法

2.3ALK陽性NSCLC的基因檢測情況本組72例免疫組化染色ALK陽性病例中20例行RT-PCR檢測9種EML4-ALK融合基因突變，結果突變率占95%(19/20)，1例未檢測到突變。本組病例均行EGFR基因突變檢測，其中4.17%(3/72)合并該基因突變(圖4)，2例為19-del突變，組織學類型為腺泡型為主，1例為L858R突變，組織學類型為實體型，其余均為野生型。

EML4-ALK融合基因Exon-6、13、20融合突變，樣本信號曲線有升起(呈S型曲線)表示該位點突變陽性

2.4ALK陽性NSCLC患者靶向治療預后情況本組72例ALK陽性NSCLC患者隨訪3～56個月，截止隨訪結束，死亡37例，生存29例，6例失訪。死亡患者確診后生存時間最短1個月，最長34個月，平均生存時間(10.69±6.32)個月。獲取隨訪資料而未用靶向藥克唑替尼治療的52例患者中34例死亡，占65.38%(34/52)，而使用克唑替尼治療的14例患者中10例治療后病情緩解或穩定，1例因肝損害治療1個療程后停藥，病情進展，3例在服藥9、27及32個月后死亡，病死率為21.4%(3/14)，平均生存時間為22.67個月，高于本組死亡患者的平均生存時間。這提示使用靶向藥物(克唑替尼)治療的患者預后好于未使用靶向治療患者，兩者差異有顯著性(χ2=8.941，P<0.01，圖5)。

3 討論

自從2007年Soda等[5]和Rikova等[6]兩個小組分別在NSCLC中發現EML4-ALK融合基因變異現象后，該基因便迅速成為肺癌分子靶向治療領域的研究熱點。2009年Shaw等[7]將ALK基因重排陽性的NSCLC定義為肺癌的一個新分子亞型，這被認為是近年來肺癌研究史上的一個里程碑式的事件。對于ALK融合基因在NSCLC的陽性率，不同人種和不同地區之間存在明顯差異，總體來說，其陽性率范圍為0.4%～11.6%，平均3.4%[5,8-9]，東亞地區中的日本、韓國和中國的陽性率分別為2.0%～6.7%、3.6%和2.9%～11.6%[9-11]，而高加索人的陽性率為0.4%～2.7%[8]。林小梅等[12]在對102例國人NSCLC患者的研究中發現EML4-ALK融合基因的陽性率為7.8%，本組中ALK融合基因的陽性率為6.88%(72/1 047)，與東亞人及我國的報道數據基本吻合。以往部分研究[7]認為EML4-ALK融合基因型者多為年輕男性、不吸煙或輕度吸煙的腺癌患者，但是也有一些獨立研究結果顯示在有吸煙史的患者也會觀測到基因返轉事件，并且認為吸煙狀態的統計結果顯示并非顯著的輔助因素[5,7]。本組ALK陽性肺癌患者中，男性40例，占55.56%(40/72)，女性32例，占44.44%(32/72)，男性患者略多于女性，但是男性患者吸煙例數較多，占92.50%(37/40)，而女性患者均不吸煙，所以無法判斷吸煙與ALK融合基因變異有關聯。但是年齡<60歲的女性患者有27例，占女性患者的84.38%(27/32)，男性僅15例，占男性患者的37.5%(15/40)，所以在本組年齡<60歲的ALK陽性NSCLC患者中女性患者多于男性患者，差異有顯著統計學意義(χ2=16.07，P<0.01)，與以往研究報道相符。本實驗還發現發生于右肺者43例，占59.72%(43/72)，發生于左肺者29例，占40.28%(29/72)，因此推測，ALK融合基因陽性肺癌可能多見于右肺。2011年Yoshida等[13]在對EML4-ALK融合基因陽性肺癌的研究中發現，所有ALK陽性患者均存在局部腺癌成分，本組72例NSCLC中腺癌70例，占97.22%(70/72)，腺鱗癌2例，無單純鱗狀細胞癌病例，與其研究結果相似。未發現單純鱗狀細胞癌病例，可能與肺鱗狀細胞癌EML4-ALK融合基因突變率極低，以及本實驗未把所有鱗狀細胞癌病例納入檢測有關，有待后續研究進一步證實。本實驗通過對肺癌不同組織學類型的對比發現ALK陽性NSCLC患者中未發現以附壁樣為主型病例，以實性為主型所占比例最大(占58.57%)，與文獻[13-14]報道相符。作者發現在實性為主型腺癌中有20例呈現一種細胞黏附性差的改變，細胞呈多邊形，胞質豐富，細顆粒狀或泡沫狀，核居中或偏位似橫紋肌樣細胞，這類癌細胞很少有黏液分泌，與印戒細胞癌不同，與其它類型肺癌對比有顯著特征性，或許能成為ALK陽性NSCLC的一個組織學特征。本組有22例癌組織中有多少不等的黏液分泌，其中以印戒樣癌細胞為主的病例3例，提示黏液分泌也是ALK陽性肺腺癌的一個特征，這與以往文獻報道類似。值得注意的是這些有黏液分泌的癌組織均呈中度或低度分化，組織學以篩狀和印戒狀細胞為主，這也與Yoshida等[13]的發現一致，而有著明顯黏液分泌的貼壁生長型腺癌(黏液性)(原來的黏液性BAC)，卻未發現ALK融合基因突變。作者對20例免疫組化染色ALK陽性的肺癌標本行RT-PCR法檢測9種EML4-ALK融合基因突變，結果突變率占95%(19/20)，僅1例未檢測到突變。不同研究的特異性和敏感性在80%～100%和90%～100%[15-16]，本組實驗結果與上述文獻相符。這個結果顯示ALK(D5F3)免疫組化染色方法簡單易行，價格低廉，可以作為可靠的篩查手段。過去人們認為ALK融合基因與EGFR突變在NSCLC中相互排斥，但本組中37例患者同時采用ARMS法進行EGFR基因檢測，結果發現3例患者共同存在EGFR突變和ALK基因融合，2例為19-del突變，組織學類型為腺泡型為主，1例為L858R突變，組織學類型為實體型，這3例患者同時也進行了ALK融合基因RT-PCR檢測，均為陽性，證實是確切的EGFR、ALK雙突變患者。近年來也有越來越多的研究發現EGFR與ALK雙突變的人群，并且這些患者可能會對EGFR-TKI或ALK-TKI有不同程度的療效[17]，本組3例術后給予易瑞沙治療，目前分別隨訪10個月、11個月和13個月，患者病情穩定，以后是否進一步應用克唑替尼治療還有待進一步隨訪證實。

圖5靶向藥物(克唑替尼)治療對非小細胞肺癌患者預后的影響

克唑替尼治療ALK陽性NSCLC患者客觀有效率達60%，無進展生存期達8～10個月，總生存期顯著延長[18]。本組14例ALK陽性NSCLC患者服用克唑替尼治療，僅3例患者死亡，病死率為21.4%，明顯低于未用克唑替尼組的病死率(65.38%)，平均生存時間22.67個月，明顯高于本組死亡患者的平均生存期[(10.69±6.32)個月]，兩組間差異也有顯著統計學意義，所以本組實驗也驗證了克唑替尼對ALK陽性NSCLC患者作用顯著，但是本實驗使用克唑替尼治療患者例數較少，還有待增加患者數量及隨訪時間進一步驗證。

綜上所述，本組實驗顯示ALK融合蛋白陽性的NSCLC多見于年齡小于60歲的患者，尤其是女性患者，數量明顯多于男性患者。組織學類型中，以實性為主型腺癌所占比例最大，組織學分化較低，部分病例癌細胞黏附性差和有黏液分泌，中晚期患者較多，預后差。使用克唑替尼治療，效果比較顯著。通過ALK融合基因RT-PCR法進行驗證，敏感性為100%，特異性為95%，因此認為Ventana抗ALK試劑和免疫組化染色是篩選ALK陽性NSCLC患者的一種非常有效的方法，對提高該類肺癌的檢出率具有重要意義。

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Non-smallcelllungcancerwithEML4-ALKpositiveexpression:aclinicopathologicalanalysisof72cases

CAO Pei-long, WANG Kai, WANG Hong-yan, ZHANG Guan-jun, WANG Chun-bao, JIANG Na, ZHAO Ying

(DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China)

PurposeTo investigate the frequency of anaplastic lymphoma kinase (ALK) expression in non-small cell lung cancer (NSCLC) patients and its correlation with the clinicopathologic features.Methods1 047 cases of non-small cell lung cancer diagnosed by pathological examination were enrolled in this study. The status of ALK was detected by Ventana anti ALK reagent and IHC staining, and the clinical characteristics and pathological features of ALK gene were analyzed.ResultsAmong 1 047 patients with non-small cell lung cancer, there are 72 cases with positive ALK (6.88%). These cases included 70 cases of adenocrcinoms and 2 adenosquamous carcinomas, with 40 males and 32 females, or 37 smokers and 35 non-smokers. The median age was 56 years and the mean age was 55.60 years. Histopathologically, 43 cases were solid predominant adnocarcinomas, 16 cases were acinar predominant adenocarcinomas, and 13 cases were papillary predominant adenocarcinomas. None were lepidic predominant adenocarcinomas.ConclusionALK gene fusion lung cancer is a new molecular subtype of non-small cell lung cancer. It has unique clinical feature and pathological morphology. Ventana anti ALK reagent and IHC staining method are the first choice for the test of ALK positive non-small cell lung cancer, which has important significance to improve the detection rate and individual treatment for this type of lung cancer.

lung neoplasms; non-small cell lung cancer; anaplastic lymphoma kinase; immunohistochemistry

R 734.2

A

1001-7399(2017)10-1092-05

時間：2017-10-23 13:30 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20171023.1330.007.html

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.10.007

接受日期：2017-08-30

西安交通大學第一附屬醫院病理科，西安 710061

曹培龍，男，碩士，主治醫師。E-mail: cpl0208@163.com