趨化因子SDF-1調控結直腸癌細胞上皮-間質轉化

張 磊，盛文文，陳術合，孫景洲

趨化因子SDF-1調控結直腸癌細胞上皮-間質轉化

張 磊，盛文文，陳術合，孫景洲

目的通過檢測Twist、SDF-1、E-cadherin在結直腸癌及癌旁組織中的表達，探討三者與上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的相關性，為腫瘤的分子靶向治療提供可能的靶標。方法收集結直腸癌和對應癌旁正常新鮮標本組織40例和結直腸癌組織及對應癌旁組織蠟塊90例，利用免疫組化SP法和qRT-PCR法檢測結直腸癌組織中SDF-1及EMT相關因子E-cadherin、Twist的表達，統計學分析SDF-1表達與E-cadherin、Twist表達之間的相關性。結果qRT-PCR結果顯示，與對應癌旁組織相比，結直腸癌組織中SDF-1、Twist mRNA的表達水平明顯升高，而E-cadherin mRNA表達水平顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)；結直腸癌組織中SDF-1、Twist的陽性率分別為75.56%、62.22%，明顯高于對應癌旁組織，而E-cadherin在腫瘤中的陽性率為28.89%，顯著低于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)。SDF-1表達與E-cadherin表達呈負相關，而與Twist表達呈正相關。結論趨化因子SDF-1高表達可能參與結直腸癌細胞的EMT過程，Twist高表達和E-cadherin低表達提示EMT現象參與結直腸癌的形成及轉移過程，并促進腫瘤的生成和轉移。

結直腸腫瘤；趨化因子；上皮-間質轉化；SDF-1

結直腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤，已經嚴重危害我國人們的身體健康。探討結直腸癌的轉移機制對患者的早期診治及提高生存率有重要意義[1-2]。基質細胞衍生因子-1(SDF-1)及其受體CXCR4信號通路在腫瘤的形成及轉移過程中起重要作用，有望成為潛在的腫瘤治療靶向位點[3-4]。上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是腫瘤細胞發生浸潤和轉移過程中首先發生的形態學變化[5]。在EMT過程中，腫瘤細胞很可能受到趨化因子的趨化作用，目前國內外也有相關文獻報道趨化因子SDF-1與EMT之間的關系。本實驗采用免疫組化SP法和qRT-PCR法聯合檢測，初步確認結直腸癌組織中SDF-1表達與EMT相關因子E-cadherin及Twist之間的相關性，探討SDF-1在EMT過程中的可能作用。

1 材料與方法

1.1一般資料收集皖西衛生職業學院附屬醫院以及安徽醫科大學附屬醫院外科2014～2016年手術切除的結直腸癌和對應癌旁正常新鮮標本組織40例(癌旁正常組織距離切緣6 cm、癌組織均經病理證實)。將標本組織放置在液氮罐中留存，待提取組織中總的RNA。同時調取該兩家醫院病理科結直腸癌組織及對應癌旁組織蠟塊90例(病理已證實)。患者年齡35～80歲，平均59.5歲。女性34例，男性56例。組織學分級：低分化60例，中+高分化30例。浸潤深度分級：肌層及漿膜下層56例，黏膜和黏膜下層34例。腫瘤直徑<5 cm者32例，直徑≥5 cm者58例。淋巴結轉移者66例。遠處轉移者45例。TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期37例，Ⅲ+Ⅳ期53例。蠟塊4 μm厚切片，烤干以備用。

1.2試劑和方法

1.2.1試劑 兔抗人SDF-1、E-cadherin及Twist多克隆抗體購自美國Invitrogen公司，SDF-1稀釋度為1 ∶50，E-cadherin及Twist稀釋度為1 ∶100；二抗試劑盒(sp9001)及DAB顯色液購自福州邁新公司。提取總RNA的試劑RNAiso Plus及qRT-PCR Sybr Green I試劑盒為Takara公司產品，英濰捷基合成SDF-1、E-cadherin、Twist及GAPDH引物，7500熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2.2方法 標本均經10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋后切片，行HE和免疫組化SP法染色。免疫組化操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行，以PBS作為陰性對照或兔IgG替代一抗。

qRT-PCR操作：把之前保存在液氮罐內的標本取出，并按照試劑盒說明書的操作流程進行總RNA提取、逆轉錄、qRT-PCR。qRT-PCR引物序列：SDF-1上游5′-ATTCTCAA CACTCCAAACTGTGC-3′，下游5′-ACTTTAGCTTCGGGTCA ATGC-3′；E-cadherin上游5′-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3′，下游5′-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3′；Twist上游5′-GCCTAGAGTTGCCGACTTATG-3′，下游5′-TGCGTTTCCTGT TAAGGTAGC-3′；GAPDH上游5′-CTCACCGGATGCACCAAT GTT-3′，下游5′-CGCGTTGCTCACAATGTTCAT-3′。qRT-PCR反應程序：58 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s；94 ℃ 30 s；94 ℃ 2 min；一共進行40個循環，72 ℃ 5 min。每個標本組織設有3個復孔。定量結果為反應完成后計算機進行測算。

1.3結果判斷

1.3.1免疫組化結果判斷 E-cadherin、SDF-1及Twist均呈陽性，SDF-1及Twist陽性細胞以胞質顯色清晰棕黃色，E-cadherin陽性細胞則以細胞膜和胞質顯色清晰黃色。采用半定量積分法判斷陽性結果[6]：根據細胞染色強度和陽性細胞占同類細胞總數的百分比(隨機選取10個高倍鏡視野，每個視野計數100個細胞)兩方面進行綜合判定。(1)按染色強度計分：0分為無染色；1分為淺黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。(2)按陽性細胞數計分：0～25%為0分；25%～50%為1分；50%～75%為2分；>75%為3分。將兩項得分結果相乘：≥2分為陽性，<2分為陰性。

1.3.2qRT-PCR結果判斷 測量標本組織模板Ct值。Ct值的含義是每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數。ΔCt等于Ct(目的基因)減去Ct(內參基因)，得到的ΔCt數值小則說明原始cDNA目的基因表達就高。

1.4統計學處理采用SPSS 19.0軟件進行計量資料的處理。采用χ2檢驗分析免疫組化結果，采用配對t檢驗分析qRT-PCR結果，指標間的相關性利用Spearman秩相關分析，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1qRT-PCR檢測結直腸癌和癌旁組織內E-cadherin、twistmRNA及SDF-1的表達qRT-PCR檢測SDF-1、E-cadherin及Twist蛋白在結直腸癌組織及癌旁組織中的表達，發現正常癌旁組織與結直腸癌組織對比，結直腸癌組織中SDF-1、Twist mRNA的表達水平明顯提高，而E-cadherin mRNA表達水平顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05，圖1)。

2.2SDF-1、E-cadherin及Twist在結直腸癌組織和癌旁組織中的表達免疫組化法檢測SDF-1、E-cadherin及Twist蛋白在結直腸癌組織及癌旁組織中的表達，結果顯示SDF-1、Twist表達定位于細胞質，E-cadherin部分表達定位于細胞質和細胞膜，陽性細胞呈現出棕黃色顆粒狀(圖2)。SDF-1在結直腸癌組織中的陽性率為75.56%，在相應癌旁組織中的陽性率為38.89%；Twist在結直腸癌組織中的陽性率為62.22%，癌旁組織為34.44%；E-cadherin在結直腸癌組織中的陽性率為28.89%，在相應癌旁組織中陽性率明顯升高，高達81.11%(P<0.05，表1)。

表1 結直腸癌和癌旁組織中SDF-1、Twist、E-cadherin的表達

2.3SDF-1表達與Twist及E-cadherin表達之間的相關性本組實驗結果表明，SDF-1表達與Twist表達呈正相關，與E-cadherin表達呈顯著負相關(P<0.05，表2)。

圖1 結直腸癌和癌旁組織中SDF-1(A)、Twist(B)、E-cadherin(C) mRNA的表達

ABC

圖2 結直腸癌組織中Twist(A)、E-cadherin(B)、SDF-1(C)的表達水平，SP法

3 討論

趨化因子通過細胞膜上的特異性受體發揮其生物學功能。趨化因子受體屬于G蛋白偶聯的7次跨膜受體，目前已鑒定的趨化因子受體至少有20種。根據結合配體不同可分為4類，CXC族受體(CXCR)、CC族受體(CCR)、C族受體(XCR1)和CX3C族受體(CX3CR)[7]。趨化因子最初被認為是白細胞的誘導劑，但是目前公認趨化因子可表達于包括腫瘤細胞在內的幾乎所有細胞中[8]。最新研究表明趨化因子及其受體在腫瘤的侵襲和轉移過程中起重要作用，并且可能成為腫瘤治療的新靶點[9-10]。

大量研究表明，趨化因子SDF-1在包括食管癌、肺癌、前列腺癌、結直腸癌等惡性腫瘤的演進過程中起到重要作用[11-12]。本組實驗發現在結直腸癌組織中SDF-1 RNA及蛋白水平表達均高于相應癌旁組織，并且前期實驗結果表明，DF-1表達與腫瘤細胞淋巴結轉移、遠處轉移及TNM分期密切相關(P<0.05)[13]。這些結果提示：結直腸癌中SDF-1可能參與腫瘤細胞的轉移過程，但是具體機制尚不清楚，這與之前的實驗結果一致。

EMT過程是腫瘤轉移的起始階段，在這一過程中上皮細胞逐漸向間質細胞轉變并具有侵襲作用，同時上皮標志物E-cadherin等表達逐漸減少，而間質標志物如N-cadherin及Twist等表達顯著升高[14]。現已有多篇文獻報道EMT參與腫瘤的形成及轉移過程，包括乳腺癌、前列腺癌、胃癌等[15-17]。本組實驗發現，在結直腸癌組織中也存在EMT現象，免疫組化及qRT-PCR實驗結果顯示，E-cadherin在結直腸癌組織中的表達明顯低于癌旁組織，而Twist在結直腸癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，提示EMT現象參與了結直腸癌的形成及轉移過程。

趨化作用在EMT過程中的作用未知，并且國內外文獻很少報道。Pang等[18]報道CCR7介導的趨化作用可以誘導乳腺癌細胞發生EMT，進而促進乳腺癌細胞遷移。本實驗分析了90例結直腸癌組織中趨化因子SDF-1與EMT因子E-cadherin及Twist表達的相關性，發現SDF-1表達與E-cadherin表達呈負相關，而與Twist表達呈正相關，表明了趨化因子SDF-1參與結直腸癌細胞的EMT作用。

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R 735.3

A

1001-7399(2017)10-1126-03

時間：2017-10-23 13:30 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20171023.1330.015.html

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.10.015

接受日期：2017-04-06

安徽省高校省級優秀青年人才基金重點項目(2013 SQRL147ZD)、安徽省高等學校自然科學研究一般項目(KJ2017B01)

皖西衛生職業學院基礎部解剖教研室，六安 237005

張 磊，男，碩士，副教授。E-mail: 81057268@qq.com

孫景洲，男，教授，通訊作者。E-mail: 289843592@qq.com