EDTA高壓修復法在石蠟包埋組織HPV原位雜交檢測中的應用

慈思慧，開 蕾，張二春，彭 鈞

邁新·技術交流

EDTA高壓修復法在石蠟包埋組織HPV原位雜交檢測中的應用

慈思慧，開 蕾，張二春，彭 鈞

HPV；原位雜交；EDTA

人乳頭瘤狀病毒(human papillomavirus, HPV)感染與子宮頸癌的發生、發展密切相關，應用原位雜交法檢測石蠟包埋子宮頸組織中HPV DNA的表達具有重要的輔助診斷意義[1-2]。現行試劑盒采用增強液微波修復進行預雜交，實驗要求高，操作時間長，作者在實踐中應用EDTA高壓修復法替代增強液微波修復進行預雜交，對比發現操作更為簡便、省時，且結果可靠，現介紹如下。

1 材料與方法

1.1材料隨機選取安慶市立醫院病理科2013年～2015年送檢的子宮頸活檢組織70例。

1.2試劑HPV(6/11型、16/18型)試劑盒購自福建泰普公司；EDTA(pH 9.0)(20×)、PBS緩沖液(pH 7.4)(20×)均購自福建邁新公司；陽性對照片由泰普公司提供。

1.3方法(1)切片、烤片：用徠卡切片機切片，制成3 μm厚的石蠟切片黏附于防脫片的載玻片上，60 ℃烤片30 min。(2)脫蠟：切片從烤箱中取出迅速置于二甲苯中3次，每次5 min，無水乙醇5 min，95%乙醇5 min，80%乙醇5 min，流水沖洗10 min。(3)增強組織的通透性和核酸探針的穿透性：基本方法：試劑盒說明書提供步驟，使用試劑盒內提供增強液，微波10 min×3次，流水冷卻10 min，再置于去離子水中1 min；新方法：EDTA(pH 9.0)(20×)用去離子水稀釋后，高壓噴氣6 min，流水冷卻10 min，置于去離子水中1 min。(4)雜交：根據組織大小滴加雜交液10～20 μL，蓋上潔凈的蓋玻片，將切片置于原位雜交儀中95 ℃ 5 min，迅速取出后置于濕盒內，放入37 ℃恒溫箱4～16 h。(5)檢測：取出切片，輕輕去除蓋玻片后將切片置于52 ℃ PBS緩沖液中浸泡3次，每次5 min，擦干組織周圍液體，滴加50 μL試劑A，37 ℃ 30 min；取出切片置于37 ℃ PBS緩沖液中浸泡3次，每次3 min，擦干組織周圍液體，滴加50 μL試劑B，室溫20 min；取出切片置于室溫PBS緩沖液中浸泡3次，每次3 min，擦干組織周圍液體，滴加50 μL試劑C，室溫30 min；取出置于室溫PBS緩沖液中浸泡3次，每次3 min。(6)顯色：根據需要配置足夠的DAB顯色液，室溫顯色3 min，可鏡下控制時間。(7)復染、封片：顯色后的切片流水沖洗3 min，置于Mayor蘇木精中復染30 s，鹽酸乙醇分化5 s，溫水返藍，脫水、透明、封片。

2 結果

鱗狀上皮細胞核內出現棕褐色粗顆粒即判為陽性，對隨機選取的70例組織使用基本方法檢測HPV6/11型陽性20例、陰性50例(圖1A)，新方法檢測HPV6/11型陽性23例、陰性47例(表1，圖1B)；使用基本方法檢測HPV16/18型陽性36例、陰性34例(圖2A)，新方法檢測陽性38例、陰性32例(表2，圖2B)。

①A①B②A②B

圖1A.基本方法檢測HPV6/11型結果；B.新方法檢測HPV6/11型結果圖2A.基本方法檢測HPV16/18型結果；B.新方法檢測HPV16/18型結果

表1 使用基本方法和新方法檢測HPV6/11型結果對比

χ2=0.67，P>0.05

表2 使用基本方法和新方法檢測HPV16/18型結果對比

χ2=0.50，P>0.05

3 討論

增強組織通透性常用的方法有：利用稀釋的酸、去垢劑或某些消化酶等。這種去蛋白作用較廣泛，在增強組織通透性、提高核酸探針穿透性和提高雜交信號的同時，也會影響組織結構的形態，因此對于用量和時間的把握極其重要。

現在常用的增強組織通透性的方法多為蛋白酶K或者胃蛋白酶，其配方中有的含有一定量的EDTA，故而作者嘗試使用EDTA(pH 9.0)稀釋后增強組織的通透性和核酸探針的穿透性，其結果與使用試劑盒配套的增強液效果基本一致，作者推測可能是由于在高溫高壓條件下EDTA破壞了靶DNA周圍的蛋白質，或者是打開了核酸探針穿透的通路以促進探針的滲透。兩種方法檢測的結果有一定的差異，原因可能是：(1)由于是手工操作，在操作過程中可能存在一定的差異導致了結果的差異；(2)可能是新方法檢出了基本方法漏檢的病例，但是這種可能性還需要進一步采用PCR、FISH或者其他方法進一步檢測驗證。

本組實驗結果顯示，改用EDTA(pH 9.0)高壓修復的檢出結果和試劑盒提供的方法檢出結果差異無統計學意義，因而可以推測兩種方法的陽性率基本一致，檢測效果是相似的，同時新方法在增強組織的通透性和核酸探針的穿透性的操作上較為省時、便捷。但是，由于實驗檢測病例數較少，同時還缺乏其他檢測方法加以驗證，因而下一步實驗將嘗試擴大樣本量，并采用其他檢測手段進行檢測驗證，還可以觀察不同高壓時長期檢出的結果是否有差異。

[1] Cai C, Chernock R D, Pittman M E,etal. Keratinizing-type squamous cell carcinoma of the oropharynx: p16 overexpression is associated with positive high-risk HPV status and improved survival[J]. Am J Surg, 2014,38(6):809-815.

[2] Chaturvedi A K, Engels E A, Pfeiffer R M,etal. Human papillomavirus and rising oropharyngeal cancer incidence in the United States[J]. J Clin Oncol, 2011,29(32):4294-4301.

[3] 吳 斌, 于曉紅. 子宮頸腺癌中HPV感染與發病年齡的臨床分析[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2015,31(5):514-517.

[4] 江東瑞, 王 弦, 吳 強. 熒光原位雜交技術操作的常見問題分析[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2015,31(12):1426-1427.

[5] 涂義姚, 張瑰紅, 丁凱陽, 等. 彌漫大B細胞淋巴瘤中miR-339-5p的表達及意義[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2015,31(4):409-412, 417.

[6] 巴瑞琪, 丁曉華. 宮頸病變人乳頭瘤病毒感染及型別分布的研究[J]. 華中科技大學學報(醫學版), 2006,35(6):838-840.

[7] 謝 敏, 石端博, 高 鵬. 乳腺導管內乳頭狀瘤中HPV原位雜交[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2013,29(9):938-941.

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1001-7399(2017)10-1161-02

時間：2017-10-23 13:30 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20171023.1330.027.html

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.10.027

接受日期：2017-04-12

安慶市立醫院病理科，安慶 246000

慈思慧，女，碩士，技師。E-mail: 403688662@qq.com