不同保存年限乳腺癌石蠟標本中HER-2 FISH檢測結果的比較

黃 瓊，劉華慶，侯 文，楊 華，劉 圣

邁新·技術交流

不同保存年限乳腺癌石蠟標本中HER-2 FISH檢測結果的比較

黃 瓊，劉華慶，侯 文，楊 華，劉 圣

乳腺腫瘤；石蠟標本；HER-2

乳腺癌HER-2狀態在對預后判斷及篩選靶向治療患者方面具有重要意義，因此準確檢測和判讀HER-2狀態顯得尤其重要；HER-2狀態目前多用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技術對HER-2基因擴增進行檢測，其具有敏感性高、特異性強等優點。乳腺癌HER-2檢測指南(2014)[1]對標本類型、標本固定及固定液、組織切片均有要求，但對石蠟標本保存年限并未作明確規定，本文對究竟保存多長時間的石蠟標本對檢測結果有影響做了進一步的探討。

1 材料與方法

1.1材料收集遵義醫學院附屬醫院病理科2006年1月～2010年12月存檔的浸潤性乳腺癌標本，且免疫組化標記HER-2蛋白表達(3+)者每年10例，(2+)者每年5例，共75例標本進行了HER-2的FISH檢測。

1.2儀器與試劑熒光顯微鏡(Olympus BX53)，原位雜交儀(Thermo Brite)，石蠟切片機(Leica RM2245)，數字酸度計(上海大普公司，PHS-25B型)，三孔水浴鍋(上海躍進公司，DK-8D)。HER-2探針試劑盒和預處理試劑盒購于雅培公司。

1.3方法(1)4 μm厚石蠟切片，二甲苯脫蠟3次×10 min，無水乙醇2次×5 min，空氣干燥。(2)預熱預處理液至80 ℃，放入切片10 min，室溫純水洗3 min。(3)切片放入預熱至37 ℃的酶溶液15～20 min，室溫純水洗3 min，37 ℃干燥。(4)70%乙醇、85%乙醇、無水乙醇脫水各1 min，37 ℃干燥。(5)暗室內在樣本區域加探針10 μL，蓋上蓋玻片，橡膠膠水四周封固，將切片放入雜交儀中，75 ℃ 5 min，37 ℃ 16 h。(6)用鑷子去除橡膠膠水，浸入室溫洗滌液，直到蓋玻片脫落；再放入預熱至72 ℃的洗滌液中2 min，取出37 ℃干燥。(7)加DAPI 10 μL，蓋上蓋玻片，-20 ℃放置30 min。(8)取出切片恢復至室溫，在暗室中熒光顯微鏡下閱片。

1.4FISH檢測結果判定參照乳腺癌HER-2檢測指南(2014)對FISH的染色要求和結果判讀：先對HE染色切片中的癌細胞區域進行確定，選擇細胞核大小一致，核邊界完整，DAPI染色均一，細胞核無重疊，信號清晰的細胞，至少找到2個浸潤癌區域，隨機至少計數20個浸潤癌細胞核中的雙色信號。(1)當HER-2/CEP17比值≥2.0時，為HER-2陽性；HER-2/CEP17比值<2.0，但平均HER-2拷貝數/細胞≥6.0時也為HER-2陽性。(2)HER-2/CEP17比值<2.0且平均HER-2拷貝數/細胞<4.0時為HER-2陰性。(3)HER-2/CEP17比值<2.0且平均HER-2拷貝數/細胞<6.0，但≥4.0時為HER-2結果不確定。

2 結果

對檢測的75例樣本進行評估(表1)，結果顯示保存6年的石蠟標本出現2例陰性，但內對照紅綠信號正常，對檢測基本無影響；保存7年的部分標本信號減弱，3例陰性；保存8年的標本信號減弱更明顯，5例陰性；保存9年的標本7例有極弱的信號但鏡下可判定為陽性，另外8例陰性；保存10年的標本有1例鏡下可判定為陽性，其他標本可見極少、極弱的紅綠信號，部分標本內對照紅綠信號消失。陽性信號的強度和數量隨著保存時間的延長而逐漸變弱和減少(圖1～3)。

3 討論

確診為浸潤性乳腺癌的患者均應行HER-2檢測，利于患者的預后判斷和靶向治療；陽性患者使用曲妥珠單抗藥物可以提高腫瘤對藥物的反應性，增加了無進展生存期和總生存時間，降低乳腺癌患者的復發率和病死率。FISH是目前認為檢測乳腺癌HER-2的金標準，檢測時應提供保存合格的標本，以提高檢測結果的可靠性。假陰性結果可能使曲妥珠單抗治療潛在獲益患者失去治療機會；假陽性結果則會導致患者持續1年治療無效，付出高昂費用并可能產生毒副作用[2]。

部分患者由于確診時間較長，或由于當時不具備FISH檢測條件，以及復發或轉移后無法重新取材，只能用首次診斷的標本來檢測，那么保存多久的石蠟標本對檢測結果無影響，目前還沒有明確的時間界定。本文希望能從檔案石蠟標本中找出從雜交信號開始減弱直到信號消失的時間點，以確保檢測標本的可靠性及結果的真實性。

表1 不同保存年限石蠟標本的HER-2 FISH檢測情況

①A①B②A②B③A③B

圖1A.2010年乳腺癌標本HER-2基因呈簇狀擴增，橘紅色，信號強；B.CEP17信號為綠色，圖像組合后紅綠信號對比明顯，FISH檢測

圖2A.2008年乳腺癌標本HER-2基因呈簇狀擴增，橘紅色，信號較弱；B.CEP17信號為綠色，圖像組合后紅色信號較弱且簇狀不明顯，FISH檢測圖3A.2006年乳腺癌標本HER-2基因單個散在不呈簇，橘紅色，信號很弱；B.CEP17信號為綠色，圖像組合后紅色信號不明顯，FISH檢測

由于FISH技術的開展比免疫組化晚，且探針價格比抗體昂貴，還需要配備熒光顯微鏡和暗室，患者需要承擔更多的費用，故HER-2檢測在FISH普及前多采用免疫組化進行HER-2蛋白檢測。但FISH具有高度的穩定性和重復性，結果判定客觀，主觀影響很小，一致性極高，能更準確真實地反映HER-2的擴增狀態。對保存時間較長的蠟塊，多數病例僅行免疫組化。張虹等[3]認為免疫組化和FISH檢測HER-2結果的一致性中陰性一致率為100%，陽性一致率為96.24%。Press等[4]研究顯示HER-2蛋白檢測結果為免疫組化(3+)的病例中，FISH的陽性率為78.2%～98.9%。朱文標等[5]認為免疫組化檢測為0、1+、2+、3+中FISH的符合率分別為100%、100%、45.45%、96.55%。臨床上HER-2免疫組化(3+)的病例可直接用藥，若經濟條件許可，也可進一步進行HER-2 FISH檢測，以排除試劑和人為判讀因素；但對于免疫組化(2+)的病例，必須做HER-2 FISH檢測才能確認是否可用靶向藥物治療，故本文選用免疫組化檢測為(3+)和(2+)的病例來進行FISH實驗檢測。消化只是一個時間段，并無固定值，組織標本之間的個體差異以及不同實驗室制片過程的差異，如切片厚度、固定時間等均可能使消化時間發生改變，要統一用相同的消化時間幾乎是不可能的[6]。消化時間還與蠟塊保存時間長短有關，甲醛使DNA或蛋白質的氨基團之間形成網橋從而固定標本，但保存時間越長，交聯作用形成的大分子網絡越穩定，消化時間也需要延長；即使是同一保存時間的標本由于所含腫瘤細胞和間質成分的多少不同，消化時間也不一致。對保存6～10年的石蠟標本消化15～20 min多數較為理想，每張切片消化時均應在顯微鏡下控制，在細胞形態結構完整、清晰的基礎上充分消化，然后再行FISH檢測，確保檢測結果的可靠性。本實驗對保存6年(含6年)以上存檔的浸潤性乳腺癌標本，且免疫組化HER-2蛋白表達(3+)和(2+)的75例樣本進行了FISH檢測，結果顯示保存6年的石蠟標本對檢測基本無影響；保存7至10年的標本擴增信號強度逐漸減弱，數量逐漸減少。保存6～10年的石蠟標本的陽性率逐漸降低，分別為86.7%、80.0%、66.7%、46.7%、6.7%；保存時間較長的一些病例細胞核邊緣模糊，結構不清，信號極弱，無法進行結果判讀。但因試劑昂貴，每年檢測的病例數偏少，可能出現免疫組化陽性而FISH陰性或免疫組化可疑而FISH陽性等情況，在條件允許的情況下應多增加檢測樣本數，以進一步保證結果的準確性。

用保存6年(含6年)以內的浸潤性乳腺癌石蠟標本進行FISH檢測對結果無影響；保存10年及以上年限的樣本不應再行FISH檢測；6～9年的樣本盡量不用，若用來檢測但結果為陰性時，應結合免疫組化檢測結果，或重新取材，或用其他的檢測方法進行HER-2檢測。

[1] 《乳腺癌HER-2檢測指南(2014版)》編寫組. 乳腺癌HER-2檢測指南(2014版)[J]. 中華病理學雜志, 2014,43(4):262-266.

[2] Jahanzeb M. Adjuvant trastuzumab therapy for HER-2-positive breast cancer[J]. Clin Breast Cancer, 2008,8(4):324-333.

[3] 張 虹, 張 爽, 王 穎, 等. 運用2013版美國臨床腫瘤學會/美國病理學家協會乳腺癌HER-2檢測指南對1501例浸潤性乳腺癌的HER-2狀態進行再評估[J]. 中華病理學雜志, 2015,44(1):42-47.

[4] Press M F, Sauter G, Bemstein L,etal. Diagnostic evaluation of HER-2 as a molecular target: an assessment of accuracy and reproducibility of laboratory testing in large, prospective, randomized clinical trial[J]. Clin Cancer Res, 2005,11(18):6598.

[5] 朱文標, 鄭少秋, 盧善明, 等. IHC與FISH檢測118例乳腺浸潤性導管癌HER-2的對比分析[J]. 中國醫學創新, 2015,12(11):5-7.

[6] 陳順平. FISH中酶消化細胞的幾點體會[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2010,26(1):116.

R 737.9

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1001-7399(2017)10-1163-03

時間：2017-10-23 13:30 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20171023.1330.028.html

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.10.028

接受日期：2017-07-27

遵義市科技計劃課題[遵市科合社字(2014)62號]

遵義醫學院附屬醫院病理科，遵義 563003

黃 瓊，女，技師。Tel: (0851)28608053，E-mail:673744387@qq.com

劉華慶，男，主任技師，通訊作者。Tel: (0851)28608053，E-mail: liuhuaqing818@163.com