鳶尾甲黃素A對脂多糖誘導小鼠RAW264.7細胞分泌炎性因子的調節作用

鄒桂欣 ，孫小玲 ，王光函 ，尤獻民，李國信

（1.遼寧省中醫研究院，遼寧 沈陽 110034； 2.遼寧省藥品檢驗檢測院，遼寧 沈陽 110023）

鳶尾甲黃素A對脂多糖誘導小鼠RAW264.7細胞分泌炎性因子的調節作用

鄒桂欣1，孫小玲2，王光函1，尤獻民1，李國信1

（1.遼寧省中醫研究院，遼寧 沈陽 110034； 2.遼寧省藥品檢驗檢測院，遼寧 沈陽 110023）

目的 研究射干中鳶尾甲黃素A對脂多糖（LPS）誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7分泌炎性因子一氧化氮（NO）和白細胞介素6（IL－6）的調節作用。方法 采用LPS誘導RAW264.7細胞，建立細胞炎性反應模型。用不同質量濃度的鳶尾甲黃素A進行干預，并設立空白對照組。通過噻唑藍(MTT)法測定不同質量濃度鳶尾甲黃素A對RAW264.7細胞活力的影響，Griess法檢測NO生成量，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞上清液中炎性因子IL－6的含量。結果 鳶尾甲黃素A能明顯抑制LPS誘導RAW264.7細胞生成NO和IL－6，且作用強度呈濃度依賴性。結論 鳶尾甲黃素A的抗炎作用可能與減少炎性因子NO和IL－6的生成有關。

鳶尾甲黃素A；脂多糖；RAW264.7細胞；一氧化氮；白細胞介素6；小鼠

射干是鳶尾科植物射干 Belamcandachinensis（L）.DC.干燥根狀莖，主含異黃酮類化合物[1]，包括射干苷、野鳶尾苷、鳶尾黃素、野鳶尾黃素、次野鳶尾黃素[2－3]、鳶尾甲黃素B、鳶尾甲黃素A等成分[4]，具有明顯的抗炎作用[5]。通過網絡藥理學軟件（http： ／／TCMSPnw.com ／default）對射干藥材中黃酮類成分進行口服利用度（oral bioavailability，OB）和類藥性（drug－likeness，DL）分析，結果鳶尾甲黃素A綜合得分最高，OB值約為64%，提示口服利用度良好；DL值為0.4，表明成為候選藥物的可能性較大（當化合物的 DL≥0.18時即可作為候選藥物）。但目前對鳶尾甲黃素A藥理活性的相關研究鮮見報道。本研究中以脂多糖（LPS）刺激的小鼠RAW264.7細胞為炎癥模型，觀察鳶尾甲黃素A對炎性因子一氧化氮（NO）和白細胞介素6（IL－6）作用的影響，在細胞水平上探討鳶尾甲黃素A的抗炎機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1儀器

W－CJ－1B型標準凈化工作臺（蘇州凈化設備廠）；CB150CE3型二氧化碳（三氣）培養箱（路易企業有限公司）；XDS－500C型倒置顯微鏡（上海蔡康光學儀器有限公司）；400C型離心機（北京白洋醫療器械有限公司）；酶標儀（美國柏騰儀器有限公司）；HH－S210R4型電熱恒溫水浴鍋（上海錦屏儀器儀表有限公司）；Y－LS－50A型立式壓力蒸汽消毒器（上海博迅實業有限公司）。

1.1.2試藥

DMEM高糖培養基、10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素（Hyclone公司）；胰蛋白酶（Gibco公司）；乙二胺四乙酸(EDTA)、噻唑藍(MTT）、LPS，Sigma 公司；二甲基亞砜(DMSO）、臺盼藍(Typan Blue），Amerseco 公司；小鼠 NO及IL－6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒（南京建成生物科技有限公司）。鳶尾甲黃素A（江蘇永健醫藥科技有限公司，批號為20140724）。細胞株為小鼠巨噬細胞RAW264.7（中國科學院上海細胞庫）。

1.2 方法

1.2.1藥物溶液配制

LPS溶液：取LPS粉末 5 mg，溶解在1 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）中，制成質量濃度為5 g／L的LPS溶液，使用前用含有10%血清的DMEM培養液稀釋至2 μg／mL即可。

鳶尾甲黃素A藥液：取鳶尾甲黃素A適量，加DMSO溶解，用 PBS 稀釋成質量濃度為 352，176，88，44，22，11，5.5 μg ／mL 的貯備液。

MTT 溶液：稱取 MTT 0.5 g，溶于 100 mL PBS 中，制成質量濃度為5 g／L的MTT溶液。

1.2.2細胞培養

將RAW264.7細胞置高糖DMEM培養基中，并加入 10% 青霉素及鏈霉素 100 mg ／L，在 95%O2、5%CO2、37℃條件下傳代培養。

1.2.3MTT 試驗

取對數生長期的RAW264.7細胞，制得細胞濃度為每1 mL含1×105個的單細胞懸液，接種于96孔細胞培養板中，每孔100 μL，培養過夜；吸棄各孔培養液，分組處理，即鳶尾甲黃素 A組分別加入 352，176，88，44，22，11，5.5 μg／mL 7 個質量濃度的藥液，LPS 模型組加 LPS（2 μg ／mL）溶液；空白對照組加含 10% 胎牛血清的EMDM培養液，每組平行5孔，各孔加液終體積為200 μL，在 5%CO2、37 ℃ 條件下繼續培養 24 h；然后在各孔加入 20 μL MTT 的 PBS 水溶液（5 g／mL），培養 4 h；吸棄培養液，每孔加入DMSO溶液150 μL振蕩溶解。使用酶標儀在490 nm波長處測定吸光度（OD）值，計算各組細胞活力，并將空白對照組細胞活力記作100.00%；其他各組與對照組細胞的存活百分率進行比較。

1.2.4Griess試驗

取對數生長期的RAW264.7細胞，制得細胞濃度為每1 mL含1×105個的單細胞懸液，接種于96孔細胞培養板中，每孔100 μL，培養過夜；吸棄各孔培養液，分組處理，即給藥組分別加入 22，11，5.5 μg／mL 的 3個質量濃度藥液，LPS模型組和空白對照組加入含10%胎牛血清的DMEM培養液，每組平行5孔，各空加液體積為 200 μL，處理 1 h后，空白對照組加入含有10%胎牛血清的DMEM培養液，其他各組均加LPS（2 μg ／mL）溶液，每孔加液體積為 100 μL，在 5%CO2及37℃條件下繼續培養 24 h；吸取各孔培養液 50 μL，加入等體積的Griess試劑，室溫反應10 min，用酶標儀在540 nm波長處測定 OD值，依據所測亞硝酸鈉濃度，推算各組細胞培養液中NO含量，從而計算各藥液組對LPS處理的細胞產生NO的抑制率。

1.2.5雙抗體夾心ELISA法試驗

細胞分組及處理等設計同1.2.4項，各組細胞培養24 h后，按照IL－6細胞因子的ELISA試劑盒說明書操作，吸取各孔培養液，用酶標儀在450 nm波長處測定OD，依據標準曲線，通過各組培養液中IL－6的含量計算抑制率。

1.3 統計學處理

采用SPSS 17.0統計學軟件分析，組間數據比較采用 t檢驗。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異非常顯著。

2 結果

2.1 對小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞活力的影響

MTT試驗結果顯示，隨著鳶尾甲黃素A質量濃度的增加，RAW264.7細胞被抑制的效果越明顯。與空白對照組細胞存活率相比，藥物濃度在2.75～22 μg／mL范圍內對RAW264.7細胞活力基本不產生影響。鏡下觀察，細胞狀態良好，表明在此濃度范圍內鳶尾甲黃素A無明顯細胞毒性作用。因此，選擇 22，11，5.5 μg ／mL 3個質量濃度繼續進行試驗（圖1）。

圖1 鳶尾甲黃素A對RAW264.7細胞活力的影響

2.2 對 LPS誘導小鼠 RAW264.7細胞分泌 NO的抑制

空白對照組細胞上清液中檢測到的NO濃度非常低，僅為 2.1 μmol／L。予 2 μg ／mL LPS 刺激后，巨噬細胞釋放大量的 NO （34.5 μmol／L），提示造模成功。與模型組相比，鳶尾甲黃素A作用的RAW264.7細胞上清液中，NO含量顯著減少，結果表明，質量濃度在5.5～22 μg／mL范圍內的鳶尾甲黃素A能明顯抑制LPS誘導的 NO產生（圖2）。

2.3 對LPS誘導小鼠RAW264.7細胞分泌IL－6的抑制

空白對照組細胞上清液中IL－6質量濃度為190.2 pg／mL，給予 2 μg ／mL LPS 刺激后，巨噬細胞釋放 IL －6 的含量顯著增加（5 819.2 pg／mL）。而與模型組相比，鳶尾甲黃素A 3個劑量組均可顯著抑制LPS誘導RAW264.7細胞釋放IL－6，且具有明顯的濃度依賴關系（圖3）。

圖2 鳶尾甲黃素A對巨噬細胞產生NO的影響

圖3 鳶尾甲黃素A對巨噬細胞產生IL－6的影響

3 討論

巨噬細胞是免疫效應細胞，在機體的免疫系統中起著非常重要的作用，也是體內啟動炎癥介質產生的中心細胞。LPS是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，也是革蘭陰性菌的主要致病物質，也是引起嚴重感染的直接原因[6]。當機體發生炎性反應時，LPS通過MyD88分子等途徑激活NF－κβ，啟動一系列細胞因子及其生物活性分子如NO，TNF－α，IL－6等，促進巨噬細胞釋放多種炎性因子參與反應。結果顯示，2 μg／mL的LPS作用于RAW264.7細胞24 h后，細胞存活率為99.91%，表明對細胞無毒性作用，2 μg／mL 的 LPS RAW264.7 細胞與作用24 h后，NO和IL－6的釋放量與空白對照組有顯著性差異。因此，本試驗中采用2 μg／mL的LPS作用于RAW264.7細胞。

NO是重要的天然免疫應答調節性效應分子，參與血管調節、神經傳遞、炎癥與免疫反應等過程。NO由一氧化氮合酶（NOS）催化左旋精氨酸而產生，在病理情況下NO大量合成會引起急、慢性炎性反應，誘發組織損傷和病變，進而參與某些炎癥性疾病的發生[7]。本研究結果顯示，與空白對照組相比，LPS模型組NO的分泌量增加；鳶尾甲黃素A各組的NO量均低于LPS模型組。

IL－6是近年來研究較多的一種多功能細胞因子，具有廣泛的生物學活性和潛在的臨床應用前景。本試驗結果表明，2 μg／mL的LPS刺激巨噬細胞產生大量的IL－6，與空白對照組相比，有顯著性差異；而與模型組相比，質量濃度在 5.5～22 μg／mL范圍內的鳶尾甲黃素A能顯著抑制由 LPS誘導的RAW264.7細胞釋放IL－6，并呈現良好的濃度依賴關系。

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Regulation EffectofIristectorigenin A on Secretion ofInflammatory Factor in Mouse RAW264.7 Cells Induced by Lipopolysaccharide

Zou Guixin1， Sun Xiaoling2， Wang Guanghan1， You Xianmin1， Li Guoxin1
（1.Liaoning Provincial Academy of Traditional Chinese Medicine，Shenyang， Liaoning， China 110034； 2.Liaoning Provincial Institute for Drug Control and Inspection，Shenyang，Liaoning，China 110023）

Objective To investigate the regulation effect of iristectorigenin A on secretion of inflammatory factors （NO and IL －6） in mouse RAW264.7 macrophage cells induced by lipopolysaccharide（LPS）.Methods LPS was adopted to induce RAW264.7 macrophage cells in order to establish the model of cellular inflammatory response.Different concentrations of iristectorigenin A were used to intervene the RAW264.7 macrophage cells，and the blank control was set.The effects of different concentrations of iristectorigenin A on the viability of RAW264.7 cells were determined by MTT method，the production of NO was detected by Griess method，and the content of inflammatory factor（IL － 6） in cell supernatant was detected by ELISA.Results Iristectorigenin A can significantly inhibit the production of NO and IL －6 in RAW264.7 cells induced by LPS,and the concentration of the action was in a concentration dependent manner.Conclusion The anti－ inflammatory effect of iristectorigenin A may be related to the reduction of the production of inflammatory factors（NO and IL － 6）.

iristectorigenin A；lipopolysaccharide；RAW264.7 cell；NO；IL － 6；mouse

R285.5；R282.71

A

1006－4931(2017)22－0001－03

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.22.001

國家自然科學基金[81273927]；國家“重大新藥創制”項目[SQ2017ZX090328]。

鄒桂欣（1965－），女，研究員，研究方向為中藥藥效物質基礎，（電子信箱）zou650430＠126.com。

李國信（1963－），男，博士研究生，博士研究生導師，研究方向為中藥新藥開發，（電子信箱）yying＿65＠126.com。

2017－06－06)