丁苯酞對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后Bcl—2蛋白表達(dá)影響的研究

薩麗波+李宇

【摘要】 目的 觀察丁苯酞對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后Bcl-2蛋白表達(dá)的影響及其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。方法 60只健康SD大鼠， 制備大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型， 造模成功2 h后拔除線(xiàn)栓， 再灌注， 將造模成功的SD大鼠隨機(jī)分為丁苯酞治療組、缺血再灌注組及假手術(shù)組， 每組20只。缺血再灌注組和假手術(shù)組按照150 mg/kg給予生理鹽水， 丁苯酞治療組在造模后2 h以同等劑量通過(guò)腹腔注射丁苯酞注射液。各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分均在麻醉蘇醒后進(jìn)行；在各組中各隨機(jī)選取10只大鼠， 通過(guò)TTC染色觀察腦梗死體積；各組余下大鼠進(jìn)行免疫組化檢測(cè)， 觀察Bcl-2蛋白表達(dá)的變化。

結(jié)果 三組神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；缺血再灌注組及丁苯酞治療組神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積均高/大于假手術(shù)組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。三組Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；缺血再灌注組及丁苯酞治療組Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率（20.12±3.36）%、（26.18±2.85）%均高于假手術(shù)組（3.15±0.42）%， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；丁苯酞治療組Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高于缺血再灌注組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 丁苯酞注射液對(duì)于大鼠缺血性腦損傷治療有效， 可以減輕大鼠腦缺血再灌注損傷的程度， 具有神經(jīng)保護(hù)作用， 其作用機(jī)制可能與Bcl-2蛋白表達(dá)相關(guān)， 并能延長(zhǎng)缺血再灌注治療時(shí)間窗。

【關(guān)鍵詞】 丁苯酞；腦缺血再灌注損傷；Bcl-2蛋白

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.31.113

【Abstract】 Objective To observe the effect of butylphthalide on the expression of Bcl-2 protein after cerebral ischemia reperfusion injury in rats and its neuroprotective mechanism. Methods A total of 60 healthy SD rats were used to prepare rat middle cerebral artery ischemia-reperfusion model. After 2 h of successful model， the suture was removed for reperfusion， and the successful model of SD rats were randomly divided into butylphthalide treatment group， ischemia reperfusion group and sham operation group， with 20 rats in each group. The ischemia reperfusion group and sham operation group was treated with normal saline and butylphthalide by 150 mg/kg， and butylphthalide treatment group received intraperitoneal injection of butylphthalide at the same dose 2 h after molding. The neurological deficit scores of all groups were performed after the recovery of anesthesia. 10 rats were randomly selected in each group， and the volume of cerebral infarction was observed by TTC staining. The remaining rats in each group were detected by immunohistochemistry， and the changes of Bcl-2 protein expression were observed. Results Three groups had statistically significant difference in neurological deficit score and cerebral infarction volume （P<0.05）. Ischemia reperfusion group and butylphthalide treatment group had higher/larger neurological deficit score and cerebral infarction volume than sham operation group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Three groups had statistically significant difference in positive rate of Bcl-2 protein expression （P<0.05）. Ischemia reperfusion group and butylphthalide treatment group had higher positive rate of Bcl-2 protein expression as （20.12±3.36）% and （26.18±2.85）% than （3.15±0.42）% in sham operation group， and their difference was statistically significant （P<0.05）. Butylphthalide treatment group had higher positive rate of Bcl-2 protein expression than ischemia reperfusion group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion Butylphthalide injection is effective in treating ischemic brain injury in rats. It can reduce the degree of cerebral ischemia-reperfusion injury in rats and has neuroprotective effect. Its mechanism may be related to the expression of Bcl-2 protein and it also can prolong the time window of ischemia - reperfusion therapy.endprint

【Key words】 Butylphthalide； Cerebral ischemia reperfusion injury； Bcl-2 protein

近年來(lái)， 缺血性腦血管病發(fā)病率越來(lái)越高， 已經(jīng)嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康。研究表明， 丁苯酞可以阻斷缺血性腦損傷的多個(gè)病理生理環(huán)節(jié)， 對(duì)缺血性腦血管病具有明確有效的治療作用[1]。缺血性腦血管病的主要病理基礎(chǔ)是腦缺血再灌注損傷， 而神經(jīng)細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致發(fā)病的主要機(jī)制之一。目前研究的熱點(diǎn)是通過(guò)何種途徑減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡從而達(dá)到治療的目的。本研究通過(guò)注射丁苯酞對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注部位進(jìn)行干預(yù)， 觀察其療效及對(duì)Bcl-2蛋白表達(dá)的影響， 分析丁苯酞治療缺血性腦損傷的作用機(jī)制， 為臨床治療腦梗死提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物與建立缺血再灌注模型 健康雄性SD大鼠60只， 平均體重（250±50）g， 購(gòu)置于沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。丁苯酞氯化鈉注射液的提供單位是石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司（批號(hào)：618170306）， 每100毫升注射液含丁苯酞25 mg與氯化鈉0.9 g。根據(jù)Zea線(xiàn)栓法[2]制備大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型， 造模成功2 h后拔除線(xiàn)栓， 再灌注。將造模成功的SD大鼠隨機(jī)分為丁苯酞治療組、缺血再灌注組及假手術(shù)組， 每組20只。

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法 缺血再灌注組和假手術(shù)組按照150 mg/kg給予生理鹽水。丁苯酞治療組在造模后2 h以同等劑量通過(guò)腹腔注射丁苯酞注射液， 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分均在麻醉蘇醒后進(jìn)行。在各組中各隨機(jī)選取10只大鼠， 通過(guò)TTC染色觀察腦梗死體積；各組余下大鼠進(jìn)行免疫組化檢測(cè)， 觀察Bcl-2蛋白表達(dá)的變化。

1. 3 觀察指標(biāo)及評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

1. 3. 1 神經(jīng)功能評(píng)分 按Zea評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)， 總分為4分， 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：4分為不能行走且意識(shí)水平下降；3分為行走時(shí)左側(cè)跌倒；2分為行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；1分為不能完全伸展左前肢；0分為正常， 無(wú)神經(jīng)體征。于缺血再灌注24 h后對(duì)各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分記錄。

1. 3. 2 腦梗死體積的測(cè)定（TTC染色法） 于缺血2 h再灌注24 h后將測(cè)腦梗死體積的大鼠處死， 斷頭取腦， 放置于-20℃冰箱固定30 min， 取冠狀面均勻切成2 mm的腦片， 共5片， 將腦片放入盛1% TTC溶液中37℃避光孵育30 min， 利用Luxex-F病理圖像分析儀對(duì)每個(gè)腦片的梗死面積及腦缺血側(cè)半球面積進(jìn)行分析處理， 并根據(jù)公式V=t（A1+A2+…An）-（A1+An）t/2計(jì)算出腦梗死體積和腦缺血側(cè)半球體積， 用數(shù)碼相機(jī)拍照， 輸入計(jì)算機(jī)中。

1. 3. 3 免疫組化檢測(cè)Bcl-2蛋白 各組在缺血后24 h， 丁苯酞治療組、缺血再灌注組和假手術(shù)組隨機(jī)10只大鼠， 用10%水合氯醛麻醉后斷頭取腦， 冠狀切取厚約3 mm腦組織， 取大腦半球腦組織進(jìn)行外固定， 最后進(jìn)行脫水、透明、包埋、切片處理；免疫組化染色， DAB顯色。在高倍光鏡下觀察Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)， 隨機(jī)選擇3個(gè)不重復(fù)的陽(yáng)性細(xì)胞分布區(qū)， 計(jì)算Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 組間比較應(yīng)用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

三組神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；缺血再灌注組及丁苯酞治療組神經(jīng)功能缺損評(píng)分均高于假手術(shù)組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。三組腦梗死體積比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；缺血再灌注組及丁苯酞治療組腦梗死體積均大于假手術(shù)組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。三組Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；缺血再灌注組及丁苯酞治療組Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率（20.12±3.36）%、（26.18±2.85）%均高于假手術(shù)組（3.15±0.42）%， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；丁苯酞治療組Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高于缺血再灌注組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

3 討論

丁苯酞是我國(guó)首個(gè)在腦血管領(lǐng)域擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的藥物， 為人工合成的左旋消旋體， 其結(jié)構(gòu)與芹菜籽中提取的左旋芹菜甲素的結(jié)構(gòu)相同。其主要作用靶點(diǎn)在血管內(nèi)皮， 具有抗血小板聚集、促進(jìn)血管再生、抑制自由基的活性及改善神經(jīng)功能缺損的作用。近年的多項(xiàng)臨床試驗(yàn)表明， 丁苯酞可以促進(jìn)腦缺血部位組織的血供， 改善腦組織微循環(huán)的血流， 對(duì)腦缺血具有有效的治療作用[3-5]。其可能的作用機(jī)制包括清除自由基、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、增加缺血區(qū)腦血流量、重構(gòu)缺血區(qū)微循環(huán)和抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載等， 具有較強(qiáng)的抗缺血作用， 可明顯減輕腦水腫、縮小腦梗死面積， 對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用， 改善腦能量代謝和缺血區(qū)的微循環(huán)和血流量[6]。

Czabotar等[7]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡是腦缺血再灌注損傷進(jìn)程中的重要的機(jī)制之一， 腦缺血再灌注損傷的程度與細(xì)胞凋亡的程度呈正相關(guān)。因此， 如果細(xì)胞凋亡的程度減輕， 腦組織缺血的損傷程度就可相應(yīng)的減輕， 從而達(dá)到了神經(jīng)保護(hù)的目的。Bcl-2蛋白是一種抗凋亡蛋白， 已經(jīng)證實(shí)可以參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)， 與其他的癌蛋白破壞細(xì)胞正常的增殖調(diào)控機(jī)制不同， Bcl-2蛋白的主要作用是抑制細(xì)胞凋亡。還有研究發(fā)現(xiàn)， Bcl-2蛋白高表達(dá)于線(xiàn)粒體膜， 可通過(guò)改變膜電位， 減少細(xì)胞色素C的釋放等機(jī)制發(fā)揮抑制凋亡的作用[8]。Bcl-2的作用表達(dá)與神經(jīng)細(xì)胞存活程度緊密相關(guān)， Volkmann等[9]研究表明增加腦內(nèi)Bcl-2的表達(dá)可減少腦梗死灶體積， 從而起到神經(jīng)保護(hù)作用， 在腦缺血再灌注后6 h后Bcl-2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始增加， 多數(shù)在24 h達(dá)高峰。本實(shí)驗(yàn)與上述結(jié)果相似， 丁苯酞治療組可見(jiàn)Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)數(shù)量明顯增加， 而大鼠腦缺血再灌注組在缺血24 h后， Bcl-2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞有一定的表達(dá)， 這說(shuō)明Bcl-2蛋白參與了腦缺血再灌注的過(guò)程， 丁苯酞對(duì)腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制可能是通過(guò)增加缺血部位Bcl-2蛋白表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。endprint

綜上所述， 丁苯酞具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用， 其治療缺血性腦血管病的機(jī)制較為復(fù)雜， 具體作用機(jī)制仍不十分清楚， 可能通過(guò)上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)， 使腦梗死體積縮小， 神經(jīng)功能缺損程度減輕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為臨床治療缺血性腦血管病提供了有力的理論基礎(chǔ)， 但也存在不足之處， 例如丁苯酞治療的具體作用靶點(diǎn)及途徑仍無(wú)法證實(shí)， 將來(lái)還需要進(jìn)一步探究。

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[9] Volkmann N， Marassi FM， Newmeyer DD， et al. The rheostat in the membrane： BCL-2 family proteins and apoptosis. Cell Death & Differentiation， 2014， 21（2）：206-215.endprint