Parkin基因表達(dá)對過氧化氫致線粒體損傷的保護(hù)作用

常春艷 平鋒鋒 洪善超 王曉明

(無錫市人民醫(yī)院臨床研究中心，江蘇 無錫 214194)

Parkin基因表達(dá)對過氧化氫致線粒體損傷的保護(hù)作用

常春艷 平鋒鋒 洪善超1王曉明2

(無錫市人民醫(yī)院臨床研究中心，江蘇 無錫 214194)

目的探討Parkin對過氧化氫(H2O2)引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)中線粒體穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)機(jī)制。方法應(yīng)用Western印跡檢測H2O2損傷的SH-SY5Y細(xì)胞不同時間內(nèi)源Parkin的表達(dá)；構(gòu)建pcDNA 3.1Parkin WT質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞；應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測JC-1染色，并計算線粒體膜電位變化；應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測線粒體促分裂因子hfis1 mRNA水平。結(jié)果在H2O2損傷3、6 h的SH-SY5Y細(xì)胞中Parkin蛋白水平升高，Hela細(xì)胞中，Parkin蛋白的表達(dá)可以抑制H2O2引起的線粒體膜電位降低，促進(jìn)線粒體分裂因子hfis1 mRNA的增加。結(jié)論P(yáng)arkin參與細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，其蛋白的表達(dá)可以抑制H2O2引起的線粒體異常，維持線粒體穩(wěn)態(tài)。

Parkin；帕金森?。痪€粒體穩(wěn)態(tài)

帕金森病(PD)是最常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變之一。迄今為止已經(jīng)克隆或在染色體上定位了三個常染色體隱性PD相關(guān)基因〔1〕，Parkin(PARK2)突變最常見〔2〕，該基因編碼的蛋白具有泛素E3連接酶活性，除了通過泛素蛋白酶體系統(tǒng)參與底物降解，Parkin還在信號傳導(dǎo)、DNA修復(fù)、氧化應(yīng)激和線粒體穩(wěn)態(tài)等多方面發(fā)揮重要作用〔3，4〕。目前研究顯示遺傳因素和氧化應(yīng)激均可引起線粒體功能失調(diào)并參與PD發(fā)生〔4，5〕。Parkin參與線粒體穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的機(jī)制仍不明確，本實(shí)驗(yàn)探討Parkin對過氧化氫(H2O2)引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)中線粒體穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 SH-SY5Y細(xì)胞系購自中科院細(xì)胞所；Hela細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。pcDNA 3.1-myc-his(-)A載體購自Invitrogen公司；E.Coli-DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶HindⅢ 和BamHⅠ(Fermentas公司)，兔抗-GAPDH(Sigma)，鼠抗Parkin(Cell Signal)，辣根過氧化物酶(HRP)抗鼠、抗兔IgG(上海鈺森生物)，JC-1/線粒體膜電位檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)，qPCR Master Mix (BIONEER公司)。CO2培養(yǎng)箱購自德國Heraeus公司，Heal Force生物安全柜購自上海力申科學(xué)儀器有限公司，免疫印跡的全套設(shè)備和MiniOpticonTMRT-PCR檢測系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，流式細(xì)胞儀FACSCanto Ⅱ購自美國BD公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-) Parkin WT構(gòu)建 設(shè)計并合成的Parkin引物序列為：正義鏈5′CCGGAATTCGCCACCATGATAGTGTTTGTCAGGTTC3′，反義鏈5′CGCGGATCCCACGTCGAACCAGTGGTCC3′，在引物中引入EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切酶切位點(diǎn)，用此引物從cDNA文庫中克隆全長Parkin基因片段，經(jīng)雙酶切后連入pcDNA3.1(-)載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含氨芐西林的LB平板培養(yǎng)基上，挑選陽性菌落進(jìn)行菌落PCR檢測，提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切初步鑒定，篩選出的陽性菌株送上海美吉生物公司測序。測序結(jié)果與GenBank中源基因比對，確定序列正確無誤。

1.4蛋白提取及Western印跡檢測 將SH-SY5Y細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至匯合度達(dá)到70%后，加入100 μmol/L H2O2分別處理0，3，6，12 h。收集細(xì)胞并加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液于冰上裂解細(xì)胞，收集裂解液并加入5倍上樣緩沖液，沸水浴10 min熱變性蛋白。根據(jù)目的蛋白分子量配制10%分離膠和5%濃縮膠，將蛋白樣品和蛋白Marker 加入上樣孔內(nèi)。電泳后半干法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，然后將PVDF膜浸泡于5%脫脂奶粉Tris鹽酸緩沖溶液(TBS)中，室溫?fù)u晃封閉1 h；一抗中室溫?fù)u晃2 h或者4℃孵育過夜，GAPDH和Parkin的稀釋比例分別為1∶10 000和1∶1 000；二抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光液處理后于暗室顯影。

1.5線粒體膜電位檢測 取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，以5×104個/cm2的密度接種于24孔板過夜。加入JC-1熒光染料(終濃度50 μmol/L)繼續(xù)37℃孵育30 min，DMEM洗細(xì)胞三遍。4℃離心3～4 min，沉淀細(xì)胞。然后JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次。再用100 μl JC-1染色緩沖液(1×)重懸后，流式細(xì)胞儀分析。紅光激發(fā)光波長579 nm，最大發(fā)射波長599 nm，綠光激發(fā)光波長490 nm，最大發(fā)射波長516 nm，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.6PCR引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中的基因序列設(shè)計RT-PCR引物，由上海生工合成。GAPDH 的擴(kuò)增引物：上游引物5′-TTGCCATCAATGACCCCTTCA-3′；下游引物5′-CGCCCCACTTGATTTTGGA-3′；hfis1擴(kuò)增引物：上游引物5′-AAAGGGAGCAAGGAGGAACA-3′；下游引物5′-TGGGGCTCTGTCTGCAGCAA-3′。

1.7RT-PCR法檢測hfis1 mRNA表達(dá) Trizol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后加入目的基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，94℃預(yù)變性10 min，94℃變性20 s，55℃退火35 s，共計35個循環(huán)，4℃終止反應(yīng)。擴(kuò)增結(jié)束后，根據(jù)設(shè)定的閾值獲得 Ct 值并計算出相對的目的基因表達(dá)量=2-△△Ct。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1重組pcDNA3.1(-) Parkin WT表達(dá)載體鑒定 重組后的質(zhì)粒經(jīng)雙酶切和菌落PCR法鑒定，結(jié)果為陽性的菌株送上海美吉公司測序，測序結(jié)果經(jīng)Blast與GenBank中源基因比對，序列完全正確。

2.2H2O2處理的SH-SY5Y細(xì)胞中內(nèi)源性Parkin蛋白的表達(dá) Western印跡(圖1)檢測顯示，3 h組(2.697±0.401)和6 h組(1.697±0.327)Parkin蛋白明顯高于0 h組(1.055±0.347)(Plt;0.05)，12 h組(1.355±0.426)與0 h組無統(tǒng)計學(xué)差異(Pgt;0.05)。

圖1 100 μmol/L H2O2處理不同時間對內(nèi)源性Parkin表達(dá)的影響

2.3線粒體膜電位變化 H2O2處理組相對熒光比值(221.597±69.210)明顯高于對照組(104.257±25.381)和過表達(dá)Parkin的H2O2處理組(137.697±34.526)(Plt;0.05)；對照組和過表達(dá)Parkin的H2O2處理組間無統(tǒng)計學(xué)差異(Pgt;0.05)。

2.4hfis1 mRNA表達(dá) H2O2處理組中hfis1 mRNA水平(130.137±4.385)明顯高于對照組(102.107±3.255)和過表達(dá)Parkin的H2O2處理組(57.184±4.252，Plt;0.05)；對照組hfis1 mRNA水平低于過表達(dá)Parkin的H2O2處理組(Plt;0.05)。

3 討 論

H2O2損傷可以使線粒體及細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂類及核酸的氧化，最終導(dǎo)致線粒體功能下降。線粒體能量合成出現(xiàn)障礙，進(jìn)一步造成細(xì)胞內(nèi)外離子失衡和膜電位下降，引起線粒體內(nèi)膜通透性改變。誘發(fā)細(xì)胞色素(Cyt)C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。Cyt C可以與凋亡激活因子-1及pro-caspase-9 形成凋亡小體，活化Caspase途徑，進(jìn)一步導(dǎo)致線粒體膜破裂，從而引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔6〕。本研究結(jié)果提示Parkin可能參與H2O2細(xì)胞應(yīng)激過程。這一結(jié)果與之前的研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激時Parkin轉(zhuǎn)錄促進(jìn)子活性增強(qiáng)，特異性激活Parkin轉(zhuǎn)錄，從而其蛋白水平上升相一致〔7〕。Parkin蛋白還可以作為泛素E3連接酶，通過泛素一蛋白水解酶系統(tǒng)其底物及自身蛋白泛素化，阻止氧化損傷蛋白的毒性聚集，可有效清除細(xì)胞內(nèi)垃圾蛋白積累產(chǎn)生的細(xì)胞毒性〔3〕。這可以解釋我們在無內(nèi)源Parkin表達(dá)的Hela細(xì)胞中外源引入Parkin質(zhì)粒并表達(dá)該蛋白后發(fā)現(xiàn)，Parkin蛋白的表達(dá)可以抑制過氧化氫引起的線粒體膜電位降低和促線粒體分裂蛋白hfis1 mRNA的增加。本研究提示，Parkin蛋白可以通過調(diào)節(jié)hfis1基因轉(zhuǎn)錄參與應(yīng)對氧化應(yīng)激損傷并維持線粒體穩(wěn)態(tài)。然而，Parkin對Hfis1的更深入調(diào)節(jié)機(jī)制仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1Bekris LM，Mata IF，Zabetian CP.The genetics of Parkinson disease〔J〕.J Geriatr Psychiatry Neurol，2010；23(4)：228-42.

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5Seet RC，Lee CY，Lim EC，etal.Oxidative damage in Parkinson disease：measurement using accurate biomarkers〔J〕.Free Radic Biol Med，2010；48(4)：560-6.

6Perl A，Nagy G，Gergely P，etal.Apoptosis and mitochondrial dysfunction in lymphocytes of patients with systemic lupus erythematosus〔J〕.Methods Mol Med，2004；102：87-114.

7Tan EK，Puong KY，Chan DK，etal.Impaired transcriptional upregulation of Parkin promoter variant under oxidative stress and proteasomal inhibition：clinical association〔J〕.Hum Genet，2005；118(3-4)：484-8.

〔2016-10-08修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R742.5

A

1005-9202(2017)21-5273-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.024

無錫市人民醫(yī)院一研一題基金項目(No.TY201307)

1 無錫市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 2 無錫市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

王曉明(1973-)，男，副主任醫(yī)師，博士，主要從事帕金森病病因及臨床治療研究。

常春艷(1981-)，女，助理研究員，博士，主要從事帕金森病分子生物學(xué)研究。