針刺對SAMP8小鼠海馬Flotillin-1、NEP及Aβ42表達的影響

李廣誠,龍聰,朱宏,董克禮,任丹,梁梅亭,李雅悅

(中南大學湘雅三醫院,長沙 410013)

針刺對SAMP8小鼠海馬Flotillin-1、NEP及Aβ42表達的影響

李廣誠,龍聰,朱宏,董克禮,任丹,梁梅亭,李雅悅

(中南大學湘雅三醫院,長沙 410013)

目的探討針刺對阿爾茨海默病模型小鼠SAMP8的行為學影響及其作用機制。方法將60只6月齡雄性SAMP8小鼠隨機分為針刺治療組、模型對照組和非穴位對照組,每組20只,另備同月齡雄性SAMR1小鼠20只作為正常對照組。針刺治療組采用針刺腎俞、百會、血海、膈俞進行干預。8星期后,采用Morris水迷宮對各組小鼠的行為學進行檢測,同時采用western blot檢測小鼠海馬組織Flotillin-1、NEP以及Aβ42表達情況。結果Morris水迷宮實驗中,與模型對照組比較,針刺治療組小鼠的逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.05),其停留在原平臺象限的時間和穿越原平臺次數增加(P＜0.05);與模型對照組比較,非穴位對照組小鼠的逃避潛伏期無明顯差別(P＞0.05),其停留在原平臺象限的時間和穿越原平臺次數也無明顯差別(P＞0.05)。Flotillin-1在針刺治療組的表達較模型對照組明顯減弱(P＜0.05),而在非穴位對照組與模型對照組之間,Flotillin-1的表達水平無明顯差別(P＞0.05);NEP在針刺治療組的表達較模型對照組明顯增強(P＜0.05),而在非穴位對照組與模型對照組之間,NEP的表達水平無明顯差別(P＞0.05);Aβ42在針刺治療組的表達較模型對照組明顯減弱(P＜0.05),而在非穴位對照組與模型對照組之間,Aβ42的表達水平無明顯差別(P＞0.05)。結論針刺能夠明顯改善AD模型小鼠SAMP8的學習記憶能力,降低SAMP8小鼠海馬Flotillin-1含量及上調NEP的表達,從而減少Aβ42表達,減輕神經毒性,發揮神經保護作用。

針刺療法;阿爾茨海默病;SAMP8;小鼠;癡呆

阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)是發生于老年和老年前期、以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經系統退行性病變。其主要表現為記憶障礙、失語、失用、失認等改變。AD是老年期最常見的癡呆類型,占老年期癡呆的50%～70%。AD典型病理改變是腦神經炎性斑、神經元纖維纏結、神經元減少及顆粒空泡變性等。隨著我國快速的人口老齡化進程,AD已然成為一個不可回避的公共衛生問題。

Aβ級聯學說是 AD病因機制中學界認可程度最高的發病假說。它認為Aβ啟動了AD的發病過程,Aβ的生成過多、降解減少及細胞外Aβ沉積是AD發病最原始、最重要的病因,在 AD發生、發展中起關鍵作用。Flotillin-1與Aβ的生成密切相關,可以為APP生成Aβ提供工作平臺從而促進 Aβ的產生。中性內肽酶(neprilysin, NEP)是體內催化Aβ降解的關鍵酶,是調節大腦Aβ水平的重要因素,NEP可以增加Aβ的降解。因此,對Flotillin-1、NEP的表達進行調節會影響Aβ的代謝過程。

目前AD尚沒有有效的治療策略[1]。針刺療法是中醫學的精髓之一,具有雙向調節及良性調節的特點,且操作簡便、無毒副反應,近年來針刺在AD治療中的臨床運用,顯示了十分理想的前景[2]。“補腎活血”針刺法是本課題組臨床治療阿爾茨海默病的常用方法之一,在前期研究中,筆者發現“補腎活血”針刺法能夠改善AD患者的認知功能,降低AD患者體內異構前列腺素的水平,減輕患者體內脂質過氧化狀態[3],同時筆者也在動物實驗中發現“補腎活血”針刺法能夠改善AD模型小鼠(senescence accelerated mouse P8, SAMP8)的學習記憶能力,其作用機制可能涉及抗氧化應激,抑制AChE活性,調節 Ach代謝,改善膽堿能系統功能等方面[4-7]。本研究旨在觀察針刺對AD模型小鼠SAMP8海馬Flotillin-1、NEP以及Aβ42表達的影響,從Aβ代謝角度闡釋針刺對阿爾茨海默病的治療機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6月齡雄性AD模型小鼠SAMP8共60只,同齡雄性正常老化小鼠SAMR1共20只,均由天津中醫藥大學第一附屬醫院動物實驗中心提供(實驗動物質量合格證NO0001353),小鼠體重為(24±3.5)g。

1.2 試劑與儀器

甘氨酸、Tris、SDS、Tween-20(武漢天源慧達生物科技有限公司);Na2HPO3·12H2O、NaH2PO3·2H2O、NaCl、KCl(上海國藥集團化學試劑有限公司);BPB(上海三愛思試劑有限公司);甘油(天津市化學試劑三廠);2-ME、無水甲醇(上海振興化工一廠);PVDF膜(德國Milipore公司);顯影底物(美國Thermo公司)。

Morris水迷宮(中南大學湘雅醫學院神經生物中心);電泳儀(北京六一儀器廠);電泳槽;轉移槽;低溫高速離心機。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與處理

將60只6月齡雄性SAMP8小鼠隨機分為針刺治療組、SAMP8模型對照組及SAMP8非穴位對照組,每組20只。另備20只6月齡雄性SAMR1小鼠作為正常對照組。所有小鼠均喂養于層流室,溫度為 18℃～22℃,濕度為55%～58%,飲用水及所食飼料均高溫蒸汽滅菌。

針刺治療組選取百會、血海、腎俞、膈俞。百會向后平刺 3～5 mm,血海、腎俞直刺 2～3 mm,膈俞以80°角斜向上刺2～3 mm,其中血海、腎俞、膈俞先刺激左側穴位,次日再刺激右側,交替進行。小鼠穴位定位以及針刺深度均參照《實驗針灸學》[8]。進針后,補瀉手法參考石學敏院士的針刺手法量學標準進行[9],血海、膈俞施捻轉瀉法,施針幅度為180°～360°,施針頻率為50～60次/min;腎俞、百會施捻轉補法,施針幅度 60°～90°,施針頻率為 120～150次/min,運針1 min,留針10 min。

SAMP8非穴對照組取雙側肋下固定非經非穴點,用平補平瀉捻轉手法進行刺激,施針幅度 90°,施針頻率為90次/min,運針1 min,留針10 min。

SAMP8模型對照組及SAMR1正常對照組小鼠進行與以上兩組相同時間程度的捉抓刺激。

各組每日做相應處理1次,第7天暫停1次,連續干預8星期。

1.3.2 行為學測試

在治療結束后的第1天,各組小鼠開始在Morris水迷宮中進行行為學測試。前5 d進行隱蔽平臺試驗,最后1 d進行空間探索試驗。

1.3.3 Western blot步驟

行為學結束后將小鼠迅速斷頭處死,取出完整腦組織,用冷生理鹽水沖洗后置于冰盤上剝離腦膜,取出海馬組織,將小鼠海馬組織,按照1:2的比例加入全細胞裂解液,經勻漿、超聲破碎后,用Bradford法進行蛋白定量,SDS-PAGE凝膠電泳,轉NC膜。洗滌后膜和檢測的一抗(1:500)進行結合,洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的二抗Goat Anti Rabbit IgG/HRP(1:10000),化學發光試劑檢測,X線片顯影。

1.4 統計學方法

采用SPSS18.0軟件對數據進行統計分析。所有數據以均數±標準差表示,采用單因素方差分析(One-way ANOVA),方差齊性時,用LSD或SNK檢驗進行兩兩比較;方差不齊時,用秩和檢驗,組間比較用Kruskal-Wallist test。

2 結果

2.1 各組行為學測試結果

由表 1及圖 1可見,隱蔽平臺實驗從干預后第 1天開始,模型對照組小鼠逃避潛期明顯長于正常對照組(P＜0.05);針刺治療組小鼠逃避潛伏期明顯小于模型對照組(P＜0.05),多于正常對照組(P＜0.05);模型對照組及非穴位對照組小鼠之間逃避潛伏期無明顯差別(P＞0.05)。由表2及圖2-3可見,在最后1天的探索試驗中,模型對照組小鼠停留在原平臺象限的時間和穿越原平臺次數明顯少于正常對照組(P＜0.05);針刺治療組小鼠停留在原平臺象限的時間和穿越原平臺次數明顯多于模型對照組(P＜0.05),少于正常對照組(P＜0.05);而模型對照組與非穴位對照組小鼠之間的停留時間和穿臺次數無明顯差別(P＞0.05)。

圖1 各組干預后小鼠隱蔽平臺實驗逃避潛伏期比較

圖2 各組干預后探索試驗穿越平臺次數比較

圖3 各組干預后探索試驗停留原平臺象限時間比較

表1 各組干預后小鼠隱蔽平臺實驗逃避潛伏期比較 (±s,s)

表1 各組干預后小鼠隱蔽平臺實驗逃避潛伏期比較 (±s,s)

注:與正常對照組比較1)P＜0.05;與模型對照組比較2)P＜0.05;與非穴位對照組比較3)P＜0.05

組別 n 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天正常對照組 2 0 7 3 . 3 2 ± 2 . 0 6 5 7 . 4 7 ± 3 . 8 0 3 9 . 0 8 ± 5 . 4 6 3 4 . 9 8 ± 6 . 0 7 3 2 . 2 0 ± 4 . 0 3模型對照組 2 0 7 9 . 9 5 ± 2 . 4 1 1) 6 9 . 8 8 ± 2 . 8 4 1) 6 3 . 1 6 ± 4 . 0 9 1) 5 9 . 2 6 ± 2 . 7 3 1) 5 6 . 7 0 ± 3 . 1 9 1)非穴位對照組 2 0 8 0 . 5 0 ± 2 . 5 8 1) 7 0 . 8 8 ± 3 . 7 5 1) 6 2 . 9 1 ± 2 . 9 8 1) 5 9 . 5 0 ± 2 . 5 7 1) 5 6 . 5 1 ± 3 . 2 2 1)針刺治療組 2 0 7 6 . 3 4 ± 3 . 1 2 1)2)3) 6 5 . 0 3 ± 3 . 1 7 1)2)3) 5 0 . 3 0 ± 4 . 2 2 1)2)3) 4 5 . 9 3 ± 3 . 9 6 1)2)3) 4 0 . 5 6 ± 3 . 6 9 1)2)3)

表2 各組干預后探索試驗各項指標比較 (±s)

表2 各組干預后探索試驗各項指標比較 (±s)

注:與正常對照組比較 1)P＜0.05;與模型對照組比較 2)P＜0.05;與非穴位對照組比較3)P＜0.05

組別 n 穿越平臺次數(次) 停留原平臺象限時間(s)正常對照組 20 9.00±2.20 30.98±5.85模型對照組 20 4.50±1.961) 15.43±2.601)非穴位對照組 20 4.90±2.221) 15.68±2.611)針刺治療組 20 6.90±1.681)2)3) 22.20±3.891)2)3)

2.2 Western blot結果

本研究采用 western blot方法檢測 NEP、Aβ42以及Flotillin-1在模型對照組、針刺治療組、非穴位對照組以及正常對照組小鼠海馬的表達水平。

實驗結果顯示,干預后 Flotillin-1在正常對照組的表達較模型對照組明顯減弱(P＜0.05),在針刺治療組的表達較模型對照組明顯減弱(P＜0.05),在針刺治療組的表達較正常對照組增強(P＜0.05),而非穴位對照組與模型對照組之間相比較,Flotillin-1的表達水平無明顯差異(P＞0.05);同時,Aβ42在正常對照組的表達較模型對照組明顯減弱(P＜0.05),在針刺治療組的表達較模型對照組明顯減弱(P＜0.05),在針刺治療組的表達較正常對照組增強(P＜0.05),而非穴位對照組與模型對照組之間相比較,Aβ42的表達水平無明顯差異(P＞0.05);干預后,NEP在正常對照組的表達較模型對照組明顯增強(P＜0.05),在針刺治療組的表達較模型對照組明顯增強(P＜0.05),在針刺治療組的表達較正常對照組減弱(P＜0.05),而非穴位對照組與模型對照組之間相比較,NEP的表達水平無明顯差異(P＞0.05)。詳見表3及圖4-5。

表3 各組小鼠海馬組織Flotillin-1、NEP及Aβ42的western blot數據分析 (±s)

表3 各組小鼠海馬組織Flotillin-1、NEP及Aβ42的western blot數據分析 (±s)

注:與正常對照組比較1)P＜0.05;與模型對照組比較2)P＜0.05;與非穴位對照組比較3)P＜0.05

正常對照組 2 0 0 . 7 9 0 ± 0 . 0 4 5 1 . 2 2 5 ± 0 . 0 5 0 0 . 7 2 6 ± 0 . 0 1 6模型對照組 2 0 1 . 2 9 3 ± 0 . 1 1 7 1) 0 . 7 7 4 ± 0 . 0 1 3 1) 1 . 0 8 3 ± 0 . 0 1 2 1)非穴位對照組 2 0 1 . 1 9 7 ± 0 . 0 1 1 1) 0 . 7 5 7 ± 0 . 0 1 1 1) 1 . 0 9 1 ± 0 . 0 0 7 1)針刺治療組 2 0 1 . 0 1 2 ± 0 . 0 1 0 1)2)3) 0 . 8 4 6 ± 0 . 0 1 5 1)2)3) 1 . 0 5 9 ± 0 . 0 1 2 1)2)3)

圖4 Flotillin-1、NEP及Aβ42在各組小鼠海馬組織中的表達

圖5 Flotillin-1、NEP及Aβ42在各組小鼠海馬組織的western blot分析結果

3 討論

阿爾茨海默病患者一個特征性神經病理表現就是腦實質中大量老年斑的形成,而老年斑的主要成分就是Aβ,Aβ主要是由其前體蛋白APP在β和γ分泌酶的作用下生成Aβ40、Aβ42,Aβ42易于形成具有AD特征的致密纖維狀神經炎塊斑,神經毒性較強。過多的 Aβ生成超其清除能力,導致 Aβ的絕對數量過多,不斷沉積細胞外間隙中,沉積的 Aβ纖維不斷聚集,繼而引發復雜的瀑布樣級聯反應,包括氧化應激、神經遞質丟失、Tau蛋白磷酸化、神經炎癥反應、神經元凋亡、細胞結構的破壞、金屬離子代謝紊亂等,這些反應可以導致一系列病理損傷,如淀粉樣斑塊的形成、神經元纖維纏結等,從而造成神經元的變性和功能障礙,最終導致AD的發生[10]。

APP的異常代謝途徑正是在脂筏上進行的,脂筏是膜脂雙層內含有特殊脂質及蛋白質的微區,聚集著許多蛋白質,為它們之間發生相互作用提供了平臺。研究發現脂筏在淀粉樣蛋白的生物起源和積累中發揮重要作用,這意味著脂筏在AD的發病機制中發揮重要作用[11-14]。脂筏參與了各種細胞活動,諸如細胞信號轉導、分子的識別、跨膜轉運等。脂筏蛋白(Flotillin-1)作為脂筏的主要組成成分和標記物,可以為 APP生成Aβ提供平臺。研究表明APP順序性酶切生成Aβ的異常代謝過程正是在脂筏上進行的[15],也就是說脂筏是APP生成Aβ的工作平臺。Flotillin-1與AD的發病關系密切,研究發現其在 AD患者含有β淀粉樣蛋白沉積的腦組織中表達明顯增強,并且表達強度和 Aβ的沉積程度成正比關系[16],可能是 Flotillin-1表達增強使APP生成Aβ的工作平臺增多從而導致Aβ產生過多。

NEP是位于軸突和突觸膜的Ⅱ型跨膜糖蛋白,廣泛分布于全身各組織。在腦中,特別是在易于發生 Aβ沉積的腦區如海馬、大腦皮質、上丘腦、下丘腦、杏仁核和中央灰質部位,NEP存在較多。NEP為細胞降解Aβ的主要酶,降解不溶性Aβ,因此,NEP被稱為腦內Aβ的清道夫[17]。有研究顯示NEP亞細胞定位與Aβ生成及降解部位相一致,NEP對 Aβ的降解可能發生在突觸或突觸附近及軸漿運輸的分泌小泡中[18]。大量研究表明,NEP是體內催化 Aβ降解的關鍵酶,是調節大腦 Aβ水平的重要因素。

本實驗研究表明,補腎活血針刺法能夠通過降低AD模型小鼠SAMP8小鼠海馬組織中Flotillin-1、上調NEP的表達來促進Aβ的降解,從而減少Aβ的沉積,下調 Aβ42的表達,具有減輕其神經毒性作用,并能發揮神經保護作用。

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Effect of Acupuncture on Hippocampal Flotillin-1, NEP and Aβ42 Expressions in SAMP8 Mice

LI Guang-chen,LONG Cong,ZHU Hong,DONGKe-li,REN Dan,LIANGMei-ting,LIYa-yue.Department of Traditional Chinese Medicine,Central South University Third Xiangya Hospital,Changsha410013,China

ObjectiveTo investigate the effect of acupuncture on behaviors and its mechanism of action in a SAMP8 mouse model of Alzheimer disease.MethodsSixty 6-month-old male SAMP8 mice were randomized to acupuncture, model and non--acupoint groups. Twenty male SAMP1 mice of the same age constituted a normal control group. The acupuncture group

intervention by acupuncture at Shenshu, Baihui, Xuehai and Geshu. After eight weeks, a behavioral test was performed using the Morris water maze in every group of mice. The expressions of Flotillin-1, NEP and Aβ42 in mouse hippocampus were determined by western blot.ResultsThe Morris water maze test showed that as compared with the model group, escape latency shortened significantly (P＜0.05) and the time spent in the former platform quadrant and the number of former platform position crossings increased (P＜0.05) in the acupuncture group of mice; escape latency, the time spent in the former platform quadrant and the number of former platform position crossings had no significant differences in the non-meridian-acupoint group of mice (allP＞0.05). As compared with the model group, Flotillin-1 expression decreased significantly in the acupuncture group (P＜0.05) but had no significant difference in the non-meridian-acupoint group (P＞0.05); NEP expression increased significantly in the acupuncture group (P＜0.05) but had no significant difference in the non-meridian-acupoint group (P＞0.05); Aβ42 expression decreased significantly in the acupuncture group (P＜0.05) but had no significant difference in the non-meridian-acupoint group (P＞0.05).ConclusionsAcupuncture can markedly improve learning and memory abilities in a SAMP8 mouse model of AD and reduce Flotillin-1 content and upregulate NEP expression in SAMP8 mouse hippocampus to decrease Aβ42 expression, relieve neurotoxicity and produce a neuroprotective effect.

Acupuncture therapy; Alzheimer disease; SAMP8; Mice; Dementia

1005-0957(2017)11-1356-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.11.1356

國家自然科學基金青年基金項目(81202730);湖南省自然科學基金項目(2011JJ3097);中央高校基本科研業務經費項目(2012QNZT162);湖南省中醫藥科技項目(201413)

李廣誠(1968—),男,副主任醫師,博士,Email:x7080@126.com

朱宏(1981—),男,主治醫師,博士,Email:yellingu@163.com

2017-05-06