電針對(duì)高血壓前期Dahl大鼠腎臟CaM/NO通路的影響

王建波,曲怡,張立德

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,沈陽(yáng) 110847)

電針對(duì)高血壓前期Dahl大鼠腎臟CaM/NO通路的影響

王建波,曲怡,張立德

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,沈陽(yáng) 110847)

目的探討電針對(duì)高血壓前期 Dahl鹽敏感大鼠模型腎臟 CaM-eNOS-NO信號(hào)通路的影響。方法 將30只7周齡雄性Dahl鹽敏感大鼠(Dahl salt-sensitive rats, DS)按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、針刺組和非經(jīng)非穴組。選擇7周齡雄性鹽抵抗大鼠(Dahl salt-resistant rats, DR)10只作為空白組。大鼠統(tǒng)一喂養(yǎng)于SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,在1星期適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后,改為8% NaCl高鹽飼料喂食。其間采用智能無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)監(jiān)測(cè)大鼠血壓,當(dāng)12 d后血壓值升至120～139/80～89 mmHg范圍時(shí),確定為高血壓前期大鼠模型。停止高鹽喂養(yǎng),改為普通飼料。空白組、模型組采取普通固定 15 min,不予治療;針刺組予以雙側(cè)曲池、足三里電針治療;非經(jīng)非穴組在雙側(cè)髂嵴上10～15 mm、后正中線旁開(kāi)20 mm區(qū)段內(nèi)選擇1個(gè)固定對(duì)照點(diǎn)進(jìn)行電針治療。每日1次,每星期治療6次,連續(xù)治療5星期。取大鼠左腎組織,熒光定量PCR法檢測(cè)CaM、eNOS的mRNA表達(dá),western blot和免疫組化法對(duì)eNOS進(jìn)行定量和定位檢測(cè),Elisa法測(cè)定NO含量表達(dá)。結(jié)果與空白組比較,模型組CaM、eNOS的mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05),eNOS的蛋白含量明顯減少(P＜0.05),NO含量也明顯降低(P＜0.05)。與模型組比較,針刺組CaM、eNOS的mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.05),eNOS的蛋白含量顯著增多(P＜0.05),NO含量也明顯升高(P＜0.05)。與模型組比較,非經(jīng)非穴組CaM表達(dá)雖明顯增高(P＜0.05),但是eNOS中mRNA表達(dá)、NO含量均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。結(jié)論電針曲池、足三里對(duì)高血壓前期 DS大鼠腎臟保護(hù)作用可能與上調(diào)大鼠腎臟CaM-eNOS-NO信號(hào)通路有關(guān)。

針刺療法;電針;高血壓前期;Dahl鹽敏感大鼠;eNOS;一氧化氮;穴,曲池;穴,足三里

高血壓前期是正常血壓與高血壓間的一個(gè)過(guò)渡階段。隨著高血壓疾病的危害被越來(lái)越多的人了解,高血壓前期的研究也逐漸被醫(yī)生及學(xué)者重視。已有研究證實(shí),在高血壓前期便存在臨床和亞臨床靶器官損傷和功能障礙[1]。高血壓前期雖然與心腦腎血管風(fēng)險(xiǎn)性密切相關(guān)[2],但是因?yàn)椴荒苓_(dá)到西藥降壓的標(biāo)準(zhǔn),不能進(jìn)行藥物治療。針灸根據(jù)其未病先治理論依據(jù),常用于高血壓前期的治療,療效顯著而受到重視[3-4]。但是關(guān)于針灸對(duì)高血壓前期作用機(jī)制研究卻鮮有報(bào)道。

目前研究認(rèn)為高血壓前期出現(xiàn)病理改變主要是內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[5]。內(nèi)皮細(xì)胞能通過(guò)釋放內(nèi)源性舒張收縮因子,控制血管的收縮與舒張,調(diào)節(jié)血管緊張度。一氧化氮(NO)是內(nèi)皮細(xì)胞中具有擴(kuò)血管作用的代表性內(nèi)皮衍生因子,內(nèi)皮細(xì)胞的損傷會(huì)導(dǎo)致NO的釋放與合成減少。據(jù)此,本實(shí)驗(yàn)采用Dahl鹽敏感大鼠(Dahl saltsensitive rats, DS)作為典型的大鼠高血壓前期模型,通過(guò)觀察電針曲池、足三里對(duì)DS大鼠腎臟CaM-eNOSNO信號(hào)通路的作用,探討電針對(duì)高血壓前期鹽敏感大鼠腎臟的保護(hù)機(jī)制,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選用 7周齡鹽抵抗大鼠(Dahl salt-resistant rats, DR)10只,雄性,體質(zhì)量為160～180 g;7周齡DS大鼠30只,雄性,體質(zhì)量為160～180 g,均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[許可證號(hào) SCXK(京) 2012-0001]。

將DR大鼠10只作為空白組;DS大鼠按照查隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、針刺組和非經(jīng)非穴組,每組 10只。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合2006年國(guó)家科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的規(guī)定。

1.2 主要試劑及儀器

大鼠針刺針具采用健康牌0.16 mm×10 mm不銹鋼毫針[蘇食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2011第2270872號(hào)];Trizol Reagent(Invitrogen life technologies);熒光定量PCR試劑盒(Agilent Technologies);PCR反轉(zhuǎn)試劑盒(ProtoScript First Strand);PCR引物(武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司);熒光定量 PCR儀(Applied Biosysterms 7500 Fast Real-Time PCR Systerm);氯仿(安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司);異丙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);無(wú)核酸酶水配制,由500 mL超純水和0.5 mL DEPC混合,過(guò)夜,并高壓滅菌;NO Elisa試劑盒購(gòu)自Elisa Biotech公司(Cat.#EIA-3673);EnoGene RIPA裂解液(E1WP106);EnoGene BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(E1WP201);凝 膠 制 備 試 劑 盒 (博 士 德 生 物AR0138);EnoGene 5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液(E1WP303); β-actin Mouse Monoclonal Antibody (E12-041);HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)(E030120-01);eNOS一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);ECL發(fā)光液 Thermo(Prod NCI5079 Lot PA197033)。

1.3 模型建立

大鼠統(tǒng)一在SPF級(jí)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。所有大鼠采用由北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供的含8% NaCl高鹽飼料喂食 12 d,每星期采用智能無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)監(jiān)測(cè)大鼠血壓。在飼養(yǎng)12 d后,DS大鼠血壓值升至120～139/ 80～89 mmHg范圍,認(rèn)為高血壓前期大鼠模型造模成功,停止高鹽喂養(yǎng),改為由遼寧本溪長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供的普通飼料喂養(yǎng)。

在高鹽飼養(yǎng)期間,每日更換 1次無(wú)菌墊料保證清潔;普通飼養(yǎng)時(shí),每2 d更換1次無(wú)菌墊料,自由飲水。

1.4 干預(yù)方法

空白組、模型組采用和針刺組相同的方法固定,不予以其他干預(yù);針刺組采用自制的兔臺(tái)、襪套固定方法捆綁大鼠[6]。穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]定位方法,足三里選取膝關(guān)節(jié)后外側(cè)、腓骨小頭下約5 mm處,直刺 7 mm;曲池選取橈骨近端的關(guān)節(jié)外側(cè)前方的凹陷中,直刺 4 mm。非經(jīng)非穴組選擇經(jīng)絡(luò)循行經(jīng)過(guò)較少的脅下部位選取[8],取雙側(cè)髂嵴上10～15 mm、后正中線旁開(kāi)20 mm區(qū)段內(nèi)一個(gè)固定對(duì)照點(diǎn)。接蘇州醫(yī)療用品廠有限公司出品的華佗牌電針儀,采用疏密波,其中疏波為1 Hz,密波為5 Hz;疏波時(shí)間為10 s,密波時(shí)間為15 s,電流調(diào)節(jié)至鼠尾或者下肢微微抽動(dòng)即可。每日1次,每次治療20 min,連續(xù)6 d為1個(gè)療程并休息1 d,共治療5星期。

1.5 取材

DS和 DR大鼠治療結(jié)束后,每組大鼠禁食不禁水12 h,腹腔注射 10%水合氯醛溶液,劑量按照0.4 mL/100 g給藥,待其完全麻醉后,固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,用 0.5%碘伏消毒大鼠腹部皮膚,沿腹中線迅速打開(kāi)腹腔,取大鼠左腎組織置于無(wú)菌 EP管中,經(jīng)液氮冷凍后于-80℃冰箱儲(chǔ)存。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 大鼠血壓變化

每星期用智能無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)監(jiān)測(cè)大鼠血壓,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血壓比較 (±s,mmHg)

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血壓比較 (±s,mmHg)

注:與空白組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

組別 n 治療前血壓 治療后1星期 治療后2星期 治療后3星期 治療后4星期空白組 10 113.00±3.16 107.25±6.02 111.50±3.42 115.50±3.42 119.50±1.29模型組 10 130.75±4.791) 136.50±9.811) 128.50±6.611) 132.25±4.991) 137.50±4.201)針刺組 10 134.00±2.201) 120.50±6.861)2) 116.00±2.941)2) 113.50±1.732) 118.00±2.942)非經(jīng)非穴組 10 133.75±3.301) 127.75±4.571)2) 124.75±5.741)2) 123.50±5.071)2) 125.00±2.581)2)

1.6.2 NO濃度檢測(cè)

使用 Elisa法檢測(cè) NO濃度。分別取左腎組織100 mg,加入PBS制成10%勻漿液。離心抽取上清,設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔。在標(biāo)準(zhǔn)孔依次加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品 50 μL,樣本孔中加入待測(cè)樣本 50 μL;加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)檢測(cè)的抗體100 μL,37℃水浴60 min;洗滌4～5次;加入底物A、B各50 μL,37℃避光15 min;再加入終止液50 μL,450 nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值;用標(biāo)準(zhǔn)品孔繪制y=ax+b曲線,計(jì)算出各組NO濃度。

1.6.3 CaM、eNOS的mRNA檢測(cè)

左腎組織經(jīng)液氮研磨后,以Trizol裂解方法提取總mRNA。測(cè)量mRNA濃度進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程,加入引物及擴(kuò)增所需試劑,Rox法熒光定量檢測(cè)CaM、eNOS的mRNA含量。擴(kuò)增引物序列(見(jiàn)表 2)。反應(yīng)條件如下,95℃10 min,1個(gè)循環(huán);95℃ 30 s,59℃ 30 s,72℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。使用ΔΔct法進(jìn)行數(shù)據(jù)檢測(cè)與處理。

1.6.4 Western blot檢測(cè)eNOS蛋白含量表達(dá)

取左腎組織 100 mg加入 RIPA裂解液后研磨離心,BCA法測(cè)定蛋白濃度;加入蛋白上樣緩沖液,100℃8 min。按照每組蛋白上樣量80 μg進(jìn)行電泳,電壓為濃縮膠80 V,分離膠120 V;轉(zhuǎn)膜80 mA 3 h;TBST配5%脫脂奶粉封閉,37℃ 1 h;eNOS一抗1:200稀釋,4℃過(guò)夜;二抗?jié)舛?1:2000,37℃ 1 h;使用凝膠成像系統(tǒng)曝光。

表2 各基因PCR擴(kuò)增的特異性引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間兩兩比較采用單因素方差分析,組間方差齊采用LSD檢驗(yàn)法,方差不齊采用Tamhane’s T2檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎組織NO含量比較

由表3可見(jiàn),模型組、針刺組、非經(jīng)非穴組大鼠腎組織 NO含量與空白組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。針刺組腎組織NO含量與模型組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。非經(jīng)非穴組腎組織NO含量與模型組比較,差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表3 各組大鼠腎組織NO含量比較 (±s,μmol/L)

表3 各組大鼠腎組織NO含量比較 (±s,μmol/L)

注:與空白組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

組別 n NO含量

2.2 各組大鼠腎組織CaM、eNOS中mRNA含量比較

由表4可見(jiàn),模型組、針刺組、非經(jīng)非穴組腎組織CaM、eNOS中mRNA含量與空白組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。針刺組腎組織CaM、eNOS中mRNA含量與模型組及非經(jīng)非穴組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。非經(jīng)非穴組腎組織CaM中mRNA含量與模型組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。非經(jīng)非穴組腎組織eNOS中mRNA含量與模型組比較,差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表4 各組大鼠腎組織CaM、eNOS中mRNA含量比較(±s)

表4 各組大鼠腎組織CaM、eNOS中mRNA含量比較(±s)

注:與空白組比較 1)P＜0.05;與模型組比較 2)P＜0.05;與非經(jīng)非穴組比較3)P＜0.05

組別 n CaM eNOS空白組 10 1.41±0.14 1.34±0.46模型組 10 1.00±0.001) 1.00±0.001)針刺組 10 1.95±0.131)2)3) 1.47±0.091)2)3)非經(jīng)非穴組 10 1.76±0.591)2) 1.09±0.381)

2.3 各組大鼠腎組織eNOS灰度值比較

由表 5及圖 1可見(jiàn),與空白組比較,模型組 eNOS蛋白含量顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模型組比較,針刺組 eNOS蛋白含量顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表5 各組大鼠腎組織eNOS灰度值比較 (±s)

表5 各組大鼠腎組織eNOS灰度值比較 (±s)

注:與空白組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

組別 n eNOS灰度值空白組 10 1.28±0.01模型組 10 0.98±0.031)針刺組 10 1.16±0.021)2)非經(jīng)非穴組 10 1.00±0.021)

圖1 各組大鼠腎組織eNOS蛋白表達(dá)

3 討論

近年來(lái),隨著人們飲食方式與生活方式的變化,我國(guó)高血壓發(fā)病率與相關(guān)危險(xiǎn)因素均有顯著升高趨勢(shì)。2002年衛(wèi)生部組織的全國(guó)居民27萬(wàn)人的營(yíng)養(yǎng)與健康狀況資料調(diào)查中證明,我國(guó)18歲以上居民高血壓患病率與1991年比較上升31%。體重狀況與1992年比較,成人超重率上升 39%,肥胖率上升 97%[9]。目前國(guó)際公認(rèn)高血壓病危險(xiǎn)因素為超重、高鹽膳食與中度以上飲酒,這些均與脾胃運(yùn)化息息相關(guān),為從脾胃論治高血壓前期提供了依據(jù)[10-13]。

高血壓前期往往表現(xiàn)為“眩暈”“頭痛”“不寐”等異常狀態(tài)。這些往往是因?yàn)楦哐獕簩?dǎo)致腦小動(dòng)脈痙攣,繼而發(fā)生腦動(dòng)脈硬化、腦供血不足等病理改變。歸根到底,高血壓歸屬于血管病變,故中醫(yī)病因病機(jī)也應(yīng)從血脈論治[14-17]。高血壓前期作為高血壓的一種未病狀態(tài),可選取多氣多血的陽(yáng)明經(jīng)穴位作為選穴依據(jù)。劉海華等[18]對(duì)臨床降壓常用穴位進(jìn)行 Meta文獻(xiàn)分析顯示,曲池使用頻率達(dá)48.6%,足三里使用頻率在30.6%。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)調(diào)理脾胃的原則,選用足三里作為降壓主穴,配以陽(yáng)明經(jīng)同氣相通之曲池治療高血壓前期。以期證明針刺具有保護(hù)機(jī)體,防止高血壓前期并發(fā)癥發(fā)生的作用。并據(jù)此探討針刺治療疾病機(jī)理,為臨床針灸治療疾病提供理論依據(jù)。

CaM-eNOS-NO信號(hào)通路與高血壓前期腎臟病理改變有很大關(guān)聯(lián)。NO作為內(nèi)源性血小板抑制劑及抗氧化劑,除可以使血管擴(kuò)張以外,還有維持血管內(nèi)皮抗凝和抗血栓形成的作用,在腎臟內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)中起到重要的作用。Billon A等[19]在研究中表明,敲除eNOS基因后,小鼠體內(nèi)17β-E2失去了其對(duì)血管內(nèi)皮的保護(hù)作用,說(shuō)明eNOS的存在是血管內(nèi)皮保護(hù)作用的關(guān)鍵因素。

高血壓前期作為高血壓的未病狀態(tài),并未構(gòu)成降壓藥治療標(biāo)準(zhǔn),而且經(jīng)循證醫(yī)學(xué)研究證實(shí),抗高血壓藥物的主導(dǎo)作用是控制高血壓本身,對(duì)降低靶器官損害和發(fā)生作用不大。在臨床治療中,既能控制血壓,又能保護(hù)靶器官不受損傷異常重要。本研究結(jié)果顯示,模型組DS大鼠與空白組相比,CaM,eNOS mRNA基因表達(dá)、eNOS蛋白表達(dá),腎組織NO含量均顯著降低。在經(jīng)過(guò)電針治療后,該信號(hào)通路基因蛋白表達(dá)均顯著升高。證明了電針對(duì)高血壓前期機(jī)體的保護(hù)作用,為廣大學(xué)者及臨床工作者研究針刺機(jī)制提供了新的思路。

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Effect of Electroacupuncture on Renal CaM/NO Pathway in Dahl Rats with Prehypertension

WANG Jian-bo,QU Yi,ZHANG Li-de.Ministry of Education Key Laboratory of TCM Visceral Manifestation Theory and Application,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang110847,China

ObjectiveTo investigate the effect of electroacupuncture on renal CaM-eNOS-NO signal pathway in Dahl salt-sensitive rats with prehypertension.MethodsThirty 7-week-old male Dahl salt-sensitive rats (DS) were allocated, using a random number table, to model, acupuncture and non-meridian-acupoint groups. Ten 7-week-old male Dahl salt-resistant rats (DR) were used as a blank group. The rats were fed in a SPF animal experiment center. An 8% NaCl high salt diet was provided after 1-week adaptive feeding. During the period, rat blood pressure was monitored using an intelligent noninvasive sphygmomanometer. A rat model of prehypertension was successfully made if rat blood pressure rose to 120～139/80～89 mmHg after 12 days. At that time, a high salt diet was stopped and a normal diet was provided. The blank and model groups

15-minute regular fixation and no treatment. The acupuncture group received electroacupuncture at bilateral Quchi and Zusanli. The non-meridianacupoint group received electroacupuncture at fixed control points selected between 10 and 15 mm above bilateral iliac crests 20 mm lateral to the midline. Treatment was given once daily, 6 times a week, for five consecutive weeks. The left rat kidney was taken. CaM and eNOS mRNA expressions were determined by quantitative fluorescence PCR. eNOS was quantified and located by western blot and immunohistochemical method. NO content was measured by ELISA.ResultsAs compared with the blank group, CaM and eNOS mRNA expressions, eNOS protein content and NO content decreased significantly in the model group (allP＜0.05). As compared with the model group, CaM and eNOS mRNA expressions, eNOS protein content and NO content increased significantly in the acupuncture group (allP＜0.05). As compared with the model group, CaM expression increased significantly (P＜0.05) but eNOS mRNA expression and NO content had no statistically significant differences (P＞0.05) in the non-meridian-acupoint group.ConclusionThe renoprotective effect of electroacupuncture at Quchi and Zusanli may be related to upregulating renal CaM-eNOS-NO signal pathway in DS rats with prehypertension.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Prehypertension; Dahl salt-sensitive rats; eNOS; Nitric oxide; Point, Quchi; Point, Zusanli

1005-0957(2017)11-1367-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.11.1367

遼寧省教育廳創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(LT2014021);遼寧省自然科學(xué)基金(20170540593)

王建波(1991—),男,助理實(shí)驗(yàn)師,Email:541773565@qq.com

張立德(1959—),男,教授,研究方向?yàn)楦哐獕翰∫虿C(jī)及針灸、中藥防治機(jī)制研究,Email:zhldtcm@163. com

2017-05-13