LC-MS/MS法測定人血漿中加巴噴丁的濃度Δ

許 萌，周春華，張雪寧，亢澤坤（河北醫科大學第二醫院藥學部，石家莊 050000）

·臨床藥學與研究·

LC-MS/MS法測定人血漿中加巴噴丁的濃度Δ

許 萌＊，周春華#，張雪寧，亢澤坤（河北醫科大學第二醫院藥學部，石家莊 050000）

目的：建立測定人血漿中加巴噴?。℅BP）濃度的方法。方法：血漿樣品經甲醇沉淀蛋白后，以磺胺甲噁唑為內標，采用液相色譜-串聯質譜法測定。色譜柱為Diamonsil C18，流動相為水（含0.05%甲酸）-甲醇，梯度洗脫，流速為1 mL/min，柱溫為30℃，進樣量為20 μL。采用電噴霧離子源，以多反應監測進行正離子掃描，用于定量分析的離子對分別為m/z 172.0→154.1（GBP）、m/z 279.0→124.0（內標）。結果：GBP血藥濃度在13.4～10 720.4 ng/mL范圍內線性關系良好（r＝0.992 3，n＝5），定量下限為13.4 ng/mL，最低檢測限為4.0 mg/mL；日內、日間RSD均小于10%，相對誤差為－4.93%～5.10%；提取回收率為86.2%～90.3%（RSD＜5%，n＝6），基質效應為87.6%～92.1%。采用該法測得10例癲癇患者體內GBP的血藥濃度為2 075.19～4 078.87 ng/mL（n＝20）。結論：本方法靈敏度高、專屬性好、適用性強，可用于癲癇患者體內GBP的血藥濃度監測及藥動學研究。

加巴噴丁；液相色譜-串聯質譜；血藥濃度；癲癇患者

癲癇是大腦神經元突發性異常放電導致短暫大腦功能障礙的一種慢性疾病，也是我國神經系統疾病中僅次于腦血管疾病的第二大頑癥[1]。加巴噴?。℅abapenitn，GBP）是新一代抗癲癇藥，對腦組織具有較高的親和力。與其他抗癲癇藥相比，GBP副作用小，可用于常規抗癲癇藥不能有效控制或不能耐受的局限性發作患者，以及局限性發作并繼發全身性癲癇患者的附加治療[2]。由于GBP的藥動學特征存在個體差異，藥物劑量與中毒等不良反應關系密切，且中毒癥狀與疾病癥狀不易區分[3]，因此GBP血藥濃度監測對保證患者臨床用藥安全具有重要意義。目前，GBP藥物濃度的測定方法主要包括高效液相色譜（HPLC）法、毛細管電泳-激光誘導熒光檢測法、液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法、高效液相色譜-熒光檢測法等，但均存在樣品前處理過程煩瑣、耗時長等缺點[4-7]。本研究在已有文獻的基礎上，建立了一種快速檢測人血漿中GBP濃度的LC-MS/MS法，并將其應用于臨床，以期為GBP的臨床研究及合理使用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1200型高效液相色譜儀（配有在線脫氣機、四元泵、自動進樣器，美國Agilent公司）；QTrapTM3200型三重四級桿線性離子阱質譜儀[配有電噴霧離子源（Electrospray ionization，ESI）]；Analyst 1.5.2數據處理系統（美國AB公司）；TGL-16B型離心機（上海安亭科學儀器廠）；MTN-2800D型氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；XH-C型旋渦混合器（金壇市國旺實驗儀器廠）；GT-1860QTS型超聲波清洗儀（廣東固特超聲股份有限公司）。

1.2 藥品與試劑

GBP對照品（上海士鋒生物技術有限公司，批號：EB02064，純度：99%）；磺胺甲噁唑對照品（內標，中國食品藥品檢定研究院，批號：100025-3200904，純度：99.6%）；加巴噴丁膠囊（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批準文號：國藥準字H20030662，批號：20151102，規格：0.1 g）；甲醇、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水?？瞻籽獫{由河北醫科大學第二醫院健康受試者提供。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：水（A相，含0.05%甲酸，pH＝3.6）-甲醇（B相），梯度洗脫（0～3 min，95%B；＞3～3.1 min，95%→20%B；＞3.1～13 min，20%B，進樣前按流動相初始條件平衡6 min）；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

ESI，以多反應監測（MRM）模式掃描，正離子方式檢測；噴射電壓（IS）：5 500 V；離子源溫度：650℃；霧化氣（GS1，N2）壓力：413.70 kPa；輔助氣（GS2，N2）壓力：448.18 kPa；氣簾氣（N2）壓力：206.85 kPa。用于定量分析的離子對分別為m/z 172.0→154.1[GBP，解簇電壓（DP）：40 V，碰撞能（CE）：17 eV]、m/z 279.0→124.0（內標，DP：30 V，CE：21 eV）。

2.2 溶液的制備

精密稱取GBP對照品適量，置5 mL量瓶中，加入適量甲醇，超聲（頻率：40 kHz）1 min使溶解，并用50%甲醇定容，配制成質量濃度為1 072 μg/mL的對照品貯備液。取上述貯備液適量，用50%甲醇稀釋，得質量濃度分別為 0.268、1.07、8.58、17.2、21.4、42.8、107.2、214.4 μg/mL的系列標準溶液；同法制備低、中、高質量濃度（0.67、21.4、160.8 μg/mL）的對照品溶液，用于質控（QC）樣品的制備。

精密稱取內標對照品適量，置2 mL量瓶中，加入適量甲醇，超聲（頻率：40 kHz）1 min使溶解，并用50%甲醇定容，配制成質量濃度為1 035.0 μg/mL的內標貯備液。取上述貯備液適量，用50%甲醇稀釋，得質量濃度為20.7 μg/mL的內標溶液。

上述所有溶液均置于4℃冰箱中保存，備用。

2.3 血漿樣品處理

取血漿樣品100 μL，置1.5 mL離心管中，精密加入甲醇和內標溶液各5 μL，渦旋混勻15 s，加入甲醇290 μL沉淀蛋白，渦旋混勻1 min，以離心半徑10 cm、轉速15 000 r/min離心10 min，取上清液，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液進樣分析。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性考察 在“2.1”項色譜與質譜條件下，取空白血漿、空白血漿+GBP+內標、患者用藥后的血漿樣品+內標，除不加內標外，其余均按“2.3”項下方法處理，進樣分析，考察方法的專屬性。結果顯示，在“2.1”項色譜與質譜條件下，GBP和內標的色譜峰峰形良好，保留時間分別為5.69、5.95 min，血漿中的內源性物質不干擾待測物的測定，表明該方法專屬性良好。典型色譜圖見圖1。

圖1 典型色譜圖Fig 1 Representative MRM chromatograms

2.4.2 標準曲線的繪制、定量下限和最低檢測限的考察精密量取“2.2”項下系列標準溶液及內標溶液各適量，加入至空白血漿100 μL中，得GBP質量濃度分別為13.4、53.6、428.8、857.6、1 072.0、2 144.1、5 360.2、10 720.4 ng/mL的血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析，記錄色譜圖。以待測物血藥濃度為橫坐標（x）、待測物與內標的峰面積比值為縱坐標（y），采用加權最小二乘法（w＝1/x2）進行線性回歸，得回歸方程為y＝0.070 1×10－3x+0.021 3（r＝0.992 3，n＝5），表明其血藥濃度在13.4～10 720.4 ng/mL范圍內線性關系良好，定量下限為13.4 ng/mL，最低檢測限為4.0 ng/mL。

2.4.3 精密度與準確度試驗 參照《化學藥物制劑人體生物利用度和生物等效性研究技術指導原則》[8]，精密量取“2.2”項下低、中、高質量濃度對照品溶液各適量，加至空白血漿100 μL中，配制成低、中、高質量濃度（33.5、1 072.0、8 040.0 ng/mL）的QC樣品，同時制備定量下限質量濃度（13.4 ng/mL）的血漿樣品，每質量濃度取6樣本分析，連續測定3 d，按當日隨行標準曲線計算各樣品的實測質量濃度，考察精密度和準確度，其中精密度以相對標準偏差（RSD）表示，準確度以相對誤差（RE）表示。結果顯示，各樣品日內、日間RSD均小于10%，RE為－4.93%～5.10%。精密度與準確度試驗結果見表1。

表1 精密度與準確度試驗結果Tab 1 Results of precision and accuracy tests

2.4.4 基質效應和提取回收率考察 取空白血漿100 μL，置1.5 mL離心管中，加入甲醇200 μL，渦旋混勻15 s，以離心半徑10 cm、轉速15 000 r/min離心10 min，分離上清液，吹干；在殘渣中分別加入GPB低、中、高質量濃度對照品溶液及內標溶液各適量，加入甲醇290 μL，渦旋混勻1 min，取上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾后，取續濾液進樣分析，記錄峰面積（B）。以水代替空白血漿進行上述操作，進樣分析，記錄峰面積（A）。取當日低、中、高質量濃度的QC樣品，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析，記錄峰面積（C）。每質量濃度取6樣本分析，基質效應＝B/A×100%，提取回收率＝C/B×100%?；|效應考察低、高質量濃度（33.5和8 040.0 ng/mL）血漿樣品，提取回收率考察低、中、高質量濃度（33.5、1 072.0、8 040.0 ng/mL）血漿樣品。結果表明，提取回收率分別為90.3%、86.2%、89.9%，內標的提取回收率為91.2%，RSD為2.0%～4.3%（n＝6）；基質效應為87.6%、92.1%，內標的基質效應為90.4%，表明在“2.1”項色譜與質譜條件下，可忽略基質效應的影響[9]。

2.4.5 穩定性試驗 精密量取“2.2”項下低、中、高質量濃度對照品溶液各適量，加至空白血漿100 μL中，配制成低、中、高質量濃度（33.5、1 072.0、8 040.0 ng/mL）的QC樣品各3份。分別考察室溫下放置4 h、－20℃放置40 h、－20℃至室溫反復凍融3次、－20℃冷凍保存60 d的穩定性。結果顯示，各QC樣品在上述條件下均穩定，RSD＜10%（n＝3）。

2.5 臨床應用

經醫院醫學倫理委員會審核通過后，GBP血藥濃度測定在河北醫科大學第二醫院進行。采用簡單隨機抽樣法選取2016年2－4月我院服用GBP治療的門診癲癇患者10例，年齡18～50歲，均為原發性癲癇（診斷符合國際抗癲癇聯盟2001年制定的癲癇和癲癇綜合征的診斷及分類標準[10]）。所有患者按藥品說明書口服GBP膠囊：第1天晚上給藥0.3 g；第2天為每日2次，每次0.3 g；從第3天開始，每日3次，每次0.3 g。于第5天晨起服藥前抽取靜脈血5 mL（參考藥品說明書，其消除半衰期為5～7 h，此時血藥濃度已達穩態），置肝素離心管中，于4℃下，以離心半徑10 cm、轉速15 000 r/min離心10 min，取上層血漿于－20℃保存，待測。

采用上述LC-MS/MS法測定各患者體內GBP的血藥濃度，每例患者平行測定2次。結果顯示，10例患者體內GBP的血藥濃度為2 075.19～4 078.87 ng/mL（n＝20），詳見表2。

表2 患者臨床資料和GBP血藥濃度檢測結果Tab 2 Clinical data of patients and results of plasma concentration determination of GBP

3 討論

色譜條件是實現待測物良好分離效果的前提。本研究采用Diamonsil C18反相色譜柱，并于前期試驗結果發現，以甲醇作為有機相時，待測物色譜峰峰形優于乙腈。在流動相中加入甲酸，可提高待測物的離子化效率，改善其色譜峰峰形，同時還可提高檢測靈敏度。因此，本課題組前期試驗考察了不同濃度甲酸（0.1%、0.5%、0.01%、0.05%）對待測物色譜行為的影響。結果顯示，流動相中加入0.05%甲酸可以達到改善峰形、提高靈敏度的目的，故最終確定水（含0.05%甲酸）-甲醇作為流動相。

由于GBP極性較大，沒有合適的萃取溶劑可將其從血漿中萃取出來，且固相萃取法成本較高；同時，由于GBP無紫外吸收，也不會發射熒光，若直接采用HPLC法測定則難度較大，且樣品需經過衍生化處理，操作復雜[7]；國外有文獻報道，采用LC-MS/MS法測定人血清中GBP的含量，采用液-液萃取法進行樣品預處理，需要用氮氣吹干，過程煩瑣且耗時[11]。本研究在已有文獻的基礎上建立了新的LC-MS/MS法，樣品處理采用簡單、快速、易操作的蛋白沉淀法。前期試驗分別考察了甲醇和乙腈作為沉淀試劑對待測物血藥濃度測定的影響。結果顯示，以甲醇作為沉淀試劑時，GBP的響應值較高，并且與流動相的有機相一致，因此將沉淀試劑選定為甲醇。

癲癇是神經科常見的慢性臨床綜合征，其藥物治療仍有諸多問題亟待解決[12-13]?？拱d癇藥主要包括傳統的一線藥物和新型抗癲癇藥兩大類。其中，傳統的抗癲癇藥不良反應較多，而新型抗癲癇藥（如GBP）以其不良反應少、妊娠期患者耐受性好等優點一直受到廣大醫務工作者的關注[14]。本研究采用LC-MS/MS法測定我院10例癲癇患者體內GBP的濃度。結果顯示，這10例患者的血藥濃度均在有效治療濃度范圍（有效治療濃度一般為2 000～7 000 ng/mL[3]）內。但在治療過程中，筆者發現有1例患者出現明顯的嗜睡，有2例出現惡心及胃腸不適等不良反應。GBP膠囊的不良反應大多與劑量相關，且常見于用藥早期[3]。因此，為理想地控制癲癇發作，同時最大限度地減少不良反應，建議臨床在治療時，應從小劑量開始，緩慢地增加劑量至完全控制發作[3]。

本文建立了測定人血漿中GBP的LC-MS/MS法，該方法分析靈敏度高、專屬性好、適用性強，具有良好的精密度及準確度，可用于臨床血藥濃度的監測及藥動學的研究。將該方法應用于臨床癲癇患者的血藥濃度監測，有助于臨床及時發現治療中存在的問題，開展個體化治療，保障患者用藥的安全、有效。

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Determination of the Concentration of Gabapentin in Human Plasma by LC-MS/MS

XU Meng，ZHOU Chunhua，ZHANG Xuening，KANG Zekun（Dept.of Pharmacy，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the concentration determination of gabapentin（GBP）in human plasma.METHODS：After precipitated by methanol，using sulfamethoxazole as internal standard，LC-MS/MS method was adopted.The determination was performed on Diamonsil C18column with mobile phase consisted of water（containing 0.05%formic acid）-methanol using a gradient elution program at the flow rate of 1 mL/min.The column temperature was 30 ℃，and sample size was 20 μL.The ESI was equipped and quantitative analysis was operated in positive ion and MRM mode.The mass transition ion-pairs were followed as m/z 172.0→154.1（GBP）and m/z 279.0→124.0（internal standard）.RESULTS：The linear range of GBP was 13.4-10 720.4 ng/mL（r＝0.992 3，n＝5）.The limit of quantitation was 13.4 ng/mL，and the minimum detection limit was 4.0 ng/mL.RSDs of inter-day and intra-day were all lower than 10%.Relative errors ranged－4.93%-5.10%.The recoveries ranged 86.2%-90.3%（RSD＜5%，n＝6），and matrix effects ranged 87.6%-92.1%.The plasma concentration of GBP in 10 epileptic patients ranged 2 075.19-4 078.87 ng/mL（n＝20）.CONCLUSIONS：The method is proved to be sensitive，specific，practical and suitable for plasma concentration monitoring and pharmacokinetic study of GBP in epileptic patients.

Gabapentin；LC-MS/MS；Plasma concentration；Epileptic patients

R917

A

1001-0408（2017）32-4496-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.32.08

河北省醫學科學研究重點課題計劃項目（No.20120082）

＊藥師，碩士。研究方向：藥物的質量研究與控制。電話：0311-66007385。E-mail：xumeng0622@126.com

#通信作者：副主任藥師，碩士。研究方向：藥物分析、臨床藥學。電話：0311-66007385。E-mail：zhouchunhua80@126.com

2016-12-12

2017-08-18）（編輯：張元媛）