廣東地區2016-2017年規模化豬場腹瀉病原調查分析

周 玲 ， 陳桂華 ， 伍子嫻 ， 麥凱杰 ， 李 迪 ， 王勝陽 ， 馬靜云 ， 張祥斌

(華南農業大學動物科學學院 ， 廣東 廣州 510642)

廣東地區2016-2017年規模化豬場腹瀉病原調查分析

周 玲 ， 陳桂華 ， 伍子嫻 ， 麥凱杰 ， 李 迪 ， 王勝陽 ， 馬靜云 ， 張祥斌

(華南農業大學動物科學學院 ， 廣東 廣州 510642)

為了解廣東地區導致豬群腹瀉病原的流行狀況，對廣東省部分地區的豬場進行豬群腹瀉的流行病學調查，共采集腹瀉樣品273份，采用PCR和RT-PCR的方法檢測能夠造成豬群腹瀉的病原，包括豬流行性腹瀉病毒(PEDV)，豬輪狀病毒(PoRV)，豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)，以及近年開始流行的豬德爾塔冠狀病毒(PorcineDeltacoronavirus, PDCoV)，豬庫布病毒(PorcineKobuvirus,PKoV)，豬博卡病毒(PorcineBocavirus，PBoV)，豬薩佩羅病毒(PorcineSapelovirus,PSV)。檢測結果顯示，PEDV仍然是導致豬群腹瀉的主要病原，而TGEV沒有檢測到。尤為突出的是PKV僅次于PEDV的高陽性率，因此其在豬群腹瀉中的作用值得進一步探索。

廣東省 ； 豬群腹瀉 ； 腹瀉病原調查 ； PCR

自2010年以來，我國仔豬出現大范圍厭食、嘔吐、腹瀉嚴重等臨床癥狀，傳播迅速，且發病仔豬死亡率高，對我國的養豬行業造成了重大損失。經研究表明，引起豬病毒性腹瀉的病原較為常見的有豬流行性腹瀉病毒(PEDV)，豬輪狀病毒(PorcineRotavirus，PoRV)，豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)。近年有報道指出,豬德爾塔冠狀病毒(PorcineDeltacoronavirus, PDCoV)，豬庫布病毒(PorcineKobuvirus,PKoV)，豬博卡病毒(PorcineBocavirus，PBoV)，豬薩佩羅病毒(PorcineSapelovirus,PSV)在一定程度上可以導致豬的腹瀉、嘔吐癥狀[1]。臨床樣品檢測結果表明，以上幾種腹瀉病原常常是以混合感染的形式呈現，而且對各階段豬群都易感，特別對哺乳仔豬危害最大，引起仔豬嘔吐、水樣腹瀉，致死率高[1]。本次研究主要是通過采集得到廣東省部分地區規模化豬場的腹瀉樣品，對腹瀉病原在當前腹瀉豬群中的感染情況進行流行病學調查，以期為廣東地區養豬業建立有效的綜合防控措施提供參考，降低病毒性腹瀉給養豬業帶來的經濟損失。

1 材料與方法

1.1 樣品 分別采集2016年1月至2017年4月期間，在廣東省不同地區43個規模化豬場中具有腹瀉、嘔吐、脫水、死亡等癥狀的發病豬群的糞便或腸道內容物，共273份。

1.2 主要試驗材料 核酸提取試劑盒(Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit 250-prep)，購自Axygen公司；PrimeScript?One Step RT-PCR Kit Ver. 2(Catalog No. RR057A)、DL-2 000TMDNA Marker(Catalog No. 3427Q),購自廣州瑞真生物技術有限公司(TaKaRa公司產品);核酸染料EB替代物Goldview，購自廣州美津生物技術有限公司。

1.3 引物設計與合成 用于檢測的引物分別參照GenBank上的相關序列，利用Primer 6.0引物設計軟件，根據序列保守區域設計了PEDV、RV、PDCoV、TGEV、PKoV、PBoV、PSV的特異性引物，引物信息如表1，引物送由華大基因科技服務有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 病毒核酸的提取 將腸道內容物或糞便與生理鹽水以1∶3的比列稀釋，充分震蕩后8 000 r/min離心10 min。取上清按愛思進核酸提取試劑盒說明書進行病毒核酸的抽提，產物于-80 ℃保存待用。

1.5 RT-PCR檢測 以提取的樣品核酸為模板進行RT-PCR擴增。反應體系：2× 1 Step Buffer 10 uL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 μL，模板 2 μL，用RNase Free dH2O 補足20 μL。PCR擴增程序：50 ℃ 30 min; 95 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 32個循環；72 ℃ 10 min; 4℃ 保存。PCR擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 檢測結果與分析

2.1 臨床病料檢測結果 應用PCR和RT-PCR方法對2016年1月-2017年4月采集的臨床病料進行腹瀉病原檢測，共檢測臨床病料273份，發現其中PEDV陽性病料182份，總陽性率為66.7%；PoRV陽性病料64份，總陽性率23.4%；PDCoV陽性病料47份，總陽性率17.2%；273份臨床腹瀉病料并未檢測到TGEV陽性；PKV陽性病料155份，總陽性率56.8%；PBoV陽性病料81份，總陽性率29.7%；PSV陽性病料76份，總陽性率27.8%。病原檢測結果見表2。

表2 腹瀉病原檢測結果

2.2 病料中腹瀉病原感染情況分析 對273份臨床腹瀉病料進行檢測，結果顯示,PEDV、PoRV、PDCoV、TGEV、PKoV、PBoV、PSV只有少數單獨感染，分別是PEDV單獨感染34份，RV單獨感染4份，PDCoV單獨感染4份，PKV單獨感染11份，PBoV單獨感染2份，PSV單獨感染3份，如表3。其中PEDV與其他腹瀉病原混合感染占PEDV陽性病料的81.3%，與PKV混合感染的情況最多，為94份，占PEDV與其他病原混合感染情況的66.2%。

表3 腹瀉病原單獨感染情況

2.3 不同時間腹瀉病原檢測結果分析 首先對所檢測的273份樣品進行時間的劃分，統計出以上幾種可以導致豬群腹瀉的病原在腹瀉豬群中不同時間的陽性檢出率，統計結果見中插彩版圖1。春季共檢測腹瀉樣品93份，PEDV、RV、PDCoV、TGEV、PKoV、PBoV、PSV陽性率分別為62.40%、22.58%、19.35%、0%、62.40%、27.96%、25.80%。夏季共檢測腹瀉樣品31份，PEDV、RV、PDCoV、TGEV、PKoV、PBoV、PSV陽性率分別為77.41%、45.16%、0%、0%、80.65%、9.68%、19.35%。秋季共檢測腹瀉樣品62份，PEDV、RV、PDCoV、TGEV、PKoV、PBoV、PSV陽性率分別為54.84%、27.41%、27.41%、0%、61.29%、22.58%、40.32%。冬季共檢測腹瀉樣品87份，PEDV、RV、PDCoV、TGEV、PKoV、PBoV、PSV陽性率分別為75.86%、16.09%、13.79%、0%、40.23%、43.68%、24.14%。據報道，PEDV具有季節流行性，大多流行于冬季和春季，但從本次研究結果來看，PEDV檢出率較高的為夏季77.41%和冬季75.86。PDCoV夏季的檢出率為0%，冬季的檢出率也相對較低為13.79%，可見在夏季高溫和冬季寒冷的氣候下PDCoV的繁殖和傳播得到抑制。其他病原未有明顯的季節分布。TGEV在所有時間內的檢出率都為0%，這也在一定程度上說明其在廣東地區的分布減少甚至消失。

2.4 不同豬場腹瀉病原混合感染情況分析 為了了解來源于不同豬場腹瀉樣品的病原感染情況，做數據統計發現，43個不同豬場單獨感染腹瀉病原的數量相對于混合感染極少，而且病原混合感染情況較為復雜，大多是幾種病原混合感染，如中插彩版圖2，其中PEDV以及PKoV的混合感染數量最多，這也證明了PEDV是當前導致豬群腹瀉的主要病原。雖然PKoV在健康豬群中也能檢測到，但從本次的調查結果來看，其在腹瀉豬群中普遍存在。因此，PKoV與豬群腹瀉的關系還需進一步的研究。目前復雜的混合感染情況也給臨床防疫工作帶來挑戰。

3 討論

豬的病毒性腹瀉是規模化豬場的常見病和多發病，主要由PEDV、RV、TGEV引起。自2012年PDCoV在香港首次報道[2]后，多項研究證明，PDCoV感染仔豬后可引起仔豬腹瀉、嘔吐、脫水等癥狀。為了調查PDCoV在國內豬場中的流行情況，有學者對采自湖北、江蘇、廣東、河南、安徽等地區的2013年到2014年的258份糞便樣品進行檢測，PDCoV陽性率14.3%，證實了PDCoV在我國豬場中存在[3]。2007年，匈牙利科學家在10日齡腹瀉仔豬糞便樣品中檢測到PKoV，從此開始了對豬庫布病毒的研究[4]。2012年，胡軍勇[5]等采集湖北省54個規模化豬場仔豬病料165份進行RT-PCR檢測，結果發現，PKoV在腹瀉仔豬中的感染率高達82.5%，健康仔豬中陽性率為13.23%。因此，可以推測PKoV的感染與仔豬腹瀉有一定的關系。第一例豬博卡病毒(PBo-Like Virus)于2009年由瑞典科學家首次發現并報道[6]。隨后，于2010年在中國首次檢測出了豬博卡病毒[7]。PBoV主要在斷奶仔豬中流行，目前已在中國的其他省市如江西、浙江、安徽、河北、河南、江蘇、上海、北京、新疆等地區檢測到，檢出率在12.5%～88.9%，和PKoV一樣，PBoV也能在健康豬的樣品中檢測到，檢出率為7.3%[8]。大量的研究已證實，PBoV已在中國的規模化豬場中廣泛分布。豬的薩佩羅病毒于1960年被首次報道以來，相繼被英國、日本等多個國家報道。PSV感染豬只可以引起輕度或者中度的神經系統紊亂、腹瀉、肺炎和繁殖障礙，也會表現出無明顯特征的亞臨床癥狀。2009年，蘭道亮等[9]分離出中國首株PSV,將其命名為csh，并用動物回歸試驗證實該株病毒可以引起豬腹瀉、呼吸障礙和神經癥狀。2012年，又對華東地區960份臨床糞便樣品進行RT-PCR檢測，總陽性率為17.2%。隨后有研究人員對華南地區和西南地區的PSV流行情況作了調查，陽性檢出率分別為18.21%和26.6%。綜合以上報道可以看出，能夠導致豬腹瀉的病原如PEDV、RV、TGEV、PDCoV、PKoV、PBoV、PSV已在我國規模化豬場中普遍存在。

從此次檢測結果來看，PEDV總體陽性率最高，為66.7%，其次是PKoV，陽性率為56.8%。自2010-2011年以來，我國南部10個省豬場均有暴發PEDV，豬死亡數超100萬頭，陳建飛[10]等通過在全國采樣對仔豬腹瀉病因進行分析，證明從2010年12月開始的導致大規模仔豬腹瀉的病因主要是豬流行性腹瀉病毒。而且近年來，PEDV流行范圍不斷擴大，混合感染率增高[11]，本次檢測中PEDV與其他病毒的混合感染占PEDV總陽性率的81.3%。從中可以看出PEDV是廣東地區導致豬腹瀉的主要病原。PKoV自2007年被報道后，已經被證實廣泛存在于世界豬場中[4]，2015年，Fan Yang等證明PKoV作為獨特的致病因子，產生腹瀉和特異性病理損傷，可能導致間質性肺炎，腎病和胃腸炎[12]。由于PKoV在健康豬群中也能檢測出，所以其是否與當前的豬腹瀉病情相關尚無定論，但PKoV與PEDV、RV、PDCoV、PBoV、PSV的混合感染可能是疾病發生的誘導因素。調查結果顯示，PKoV與PEDV的混合感染占PEDV與其他病原混合感染情況的66.2%，有學者認為PKoV和PEDV共感染仔豬時，可能通過某種分子機制，增強了PEDV[13]的感染力，從而使仔豬死亡率增加，具體機制目前還尚未可知。從檢測結果中可以看到，引起豬病毒性腹瀉的病原如TGEV、RV的陽性率分別為0%、23.4%，而2013年田云[14]等對廣東地區豬流行性腹瀉情況調查得到的結果分別為1.52%、16.06%，相較之下，TGEV陽性率下降，RV陽性率有所提高。雖然在本次調查中PDCoV總陽性率為17.2%，遠遠低于PEDV的檢出率，值得注意的是與2015年翟少倫[15]等針對華南地區PDCoV的流行情況做的調查結果PDCoV陽性率4.4%相比，PDCoV感染率有持續升高的勢頭。另外，已有多篇報道顯示，PBoV和PSV在國內外豬群中分布較為普遍，但其對宿主的作用機制仍不十分清楚，在生產上也相應地缺乏有效的防控措施，因此對豬群的潛在威脅不容忽視。

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InvestigationonporcinediarrheaPathogensinGuangdongprovinceform2016to2017

ZHOU Ling ， CHEN Gui-hua ， WU Zi-xian ， MAI Kai-jie ， LI Di ， WANG Sheng-yang ， MA Jing-yun ， ZHANG Xiang-bin

(College of Animal Science，South China Agricultural University ，Guangzhou 510642，China)

To evaluate the epidemic status of porcine diarrhea pathogens in Guangdong,the epidemiological investigation of diarrhea in some pig herds was conducted. In this study, 273 diarrhea samples were collected and detected by PCRor RT-PCR for diarrhea pathogens, including Porcine Epidemic Diarrhea Virus, Porcine Rotavirus, Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus,Porcine Deltacoronavirus, Porcine Kobuvirus, Porcine Bocavirus, and Porcine Sapelovirus which had been epidemic in recent years. The results showed that PEDV was still the cause of porcine diarrhea, and TGEVwas not detected. Particularly there was a high positive rate of PKoV which was only second to PEDV, Thus,the role of PKoV in porcine diarrhea is worth exploring further.

Guangdong ; porcine diarrhea ; diarrhea pathogens investigation ; PCR

ZHANG Xiang-bin

S858.28

A

0529-6005(2017)10-0003-03

2017-05-23

國家重點研發計劃專項(2016YFD0501304)

周玲(1993-),女，碩士，研究方向為動物健康養殖與安全生產，E-mail：1481075258@qq.com

張祥斌，E-mail：Zhangxb@scau.edu.cn