牛病毒性腹瀉病毒XC株的分離與鑒定

鄧 宇 , 何學謙 ， 陳紅軍 ， 張 政

(西昌學院動物科學學院，四川 西昌 615013)

牛病毒性腹瀉病毒XC株的分離與鑒定

鄧 宇 , 何學謙 ， 陳紅軍 ， 張 政

(西昌學院動物科學學院，四川 西昌 615013)

將 BVDV陽性血清樣品接種MDBK細胞，結果分離出1株BVDV 。采用MDBK細胞培養法、直接免疫熒光、RT-PCR與TCID50等方法對分離毒株進行鑒定分析。結果表明，分離株在MDBK細胞上盲傳至10代均未出現細胞病變；在直接免疫熒光試驗中呈陽性；RT-PCR擴增均獲得5'-UTR、Npro預期大小DNA片段；分離株滴度為10-5.9TCID50/0.2 mL。進化分析顯示，該分離株屬于BVDV-1m。以上結果推斷，成功分離鑒定1株BVDV，該分離株為非致細胞病變型BVDV-1m，命名為BVDV-1 XC株，為研究致病機理奠定基礎。

牛病毒性腹瀉病毒 ； 分離鑒定 ； 直接免疫熒光試驗 ； 非致細胞病變型

牛病毒性腹瀉病毒-1(Bovineviraldiarrheavirus-1，BVDV-1)、牛病毒性腹瀉病毒-2(Bovineviraldiarrheavirus-2，BVDV-2)屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)成員[1]，與豬瘟病毒(Classicalswinefevervirus， CSFV)、邊界病毒(Borderdiseasevirus，BDV)同為一屬，存在抗原交叉反應。這兩種病毒(BVDVs)的基因組均為單股正鏈RNA，其大小約為12.3 kb，在基因分型方面，通常根據BVDVs的5'-UTR， BVDV-1可分為BVDV-1a～BVDV-1u[2-5]，BVDV-2可分為BVDV2a～ BVDV2d[6-7]。在生物型分類方面，基于病毒接種細胞是否產生病變將BVDVs分為致細胞病變型(Cytopathic effects，CPE)、非致細胞病變型(Noncytopathic，NCP)兩種生物型。

本研究從西昌某牛場臨床健康的奶牛血清樣品中分離出一株BVDV毒株，將其命名為BVDV-1 XC株，生物型為NCP型。這為NCP型BVDV致病機制研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、標準毒株和主要試劑 MDBK細胞、BVDV 標準陽性對照毒株NADL，本實驗室保存。病毒RNA提取試劑盒、2×PCRTaqMix等，購自天根生化科技(北京)有限公司；AMV反轉錄酶、克隆載體pMD19-T等，購自TaKaRa生物技術公司；牛血清、PBS、RPMI-1640培養基來自Hyclone產品；FITC標記BVDVs抗體來自美國VMRD公司產品。

1.2 樣品來源與病毒分離 牛血清樣品于2015年9月采自四川西昌某牛場臨床健康的奶牛，將牛血清加入2倍PBS充分混勻，凍融3次，用0.22 μm濾器過濾，加入雙抗(1 000 IU(μg)/mL)，接種至基本長滿單層的MDBK，37 ℃，5%CO2吸附2 h，期間輕搖2～3次后棄上清，PBS洗滌2次，加入含10%牛血清的RPMI-1640在37 ℃，5%CO2條件下培養，72 h收集細胞培養物。盲傳至10代，每代次細胞培養物置-75 ℃保存備用。

1.3 分離株的鑒定

1.3.1 RT-PCR鑒定 根據參考文獻[5, 11-12]，設計合成引物，建立BVDV5'-UTR RT-PCR以及NproRT-PCR檢測方法，對收集的細胞培養物進行檢測，克隆測序。

1.3.2 抗原性鑒定(直接免疫熒光試驗) 第4代分離毒株接種至基本長滿單層的6孔板MDBK細胞，將BVDV NADL株、生理鹽水分別設為陽性對照、陰性對照。置于37 ℃，5%CO2培養箱中培養72 h后，根據FITC標記BVDV抗體試劑盒的操作說明書做直接免疫熒光試驗(FA)，于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.3.3 病毒TCID50測定 用含2%牛血清細胞培養基將分離毒株第5代病毒作10-1～10-8倍比稀釋，分別接種于96孔細胞板，每一稀釋度平行接4孔，200 μL/孔。同時設定4孔加入2%牛血清細胞培養基作為陰性對照， 37 ℃，5%CO2條件下培養72 h后，參照1.3.2方法進行染色、判定，記錄熒光呈陽性的孔數及其稀釋度，采用k?rber公式計算TCID50。

1.3.4 遺傳進化關系分析 采用Mega5.1軟件對BVDV XC株 5′-UTR、Npro與GenBank中已公布的瘟病毒參考株相應的序列進行多序列比對，構建遺傳進化樹(用該軟件參數：N-J法，Kimura 2-parameter，Transitions + Transversions，Bootstrap值1 000)分別構建5′-UTR(245 bp)、Npro(504 bp)，確定分離株與瘟病毒屬其他毒株之間進化關系。

2 結果

2.1 分離毒株細胞傳代培養及生物型鑒定 凍融3次的牛血清樣品接種MDBK細胞，盲傳至第8代，接種樣品細胞(圖1C)72 h后仍為NCP，與陰性對照組細胞(圖1B)生長狀態基本類似，無明顯差異，結果表明，該分離株屬于NCP生物型。標準陽性對照BVDV NADL株接種后72 h后出現明顯CPE(圖1A)，細胞出現明顯空泡、圓縮、拉網等現象。

圖1 細胞傳代培養結果 (200×)

2.2 分離株 RT-PCR鑒定結果 采用RT-PCR對病毒盲傳的第4代、第8代進行5'-UTR檢測，結果均出現約309 bp大小的特異性片段(圖2)，克隆、測序特異性片段，NCBI Blast結果顯示，獲得的序列為BVDV-1序列。

對分離株盲傳第4代、第8代Npro基因進行RT-PCR檢測，如圖3所示，結果均擴增出約504 bp 大小的特異性片段，經克隆、測序，NCBI Blast顯示，分離株為BVDV-1。

2.3 抗原性鑒定及毒力測定(TCID50) 分離株第4代感染MDBK細胞72 h后，用FA方法檢測感染細胞，結果顯示，被分離株感染的細胞、陽性對照，均出現特異性熒光反應。陰性對照無熒光反應(圖4C)。

采用所建立的FA進行毒力測定，結果顯示，0.2 mL分離株細胞培養上清中含105.9TCID50。

2.4 遺傳進化分析

2.4.1 分離株 5'-UTR進化樹構建 根據BVDV-1 5'-UTR序列所建立的進化樹(圖4)顯示，分離株XC與BVDV-1m參考株ZM-95、LZ05在一個分支上。與其他BVDV-1參考株序列進行核苷酸同源性分析發現，該分離株與LZ05 、ZM-95核苷酸同源最高，分別為98.4%、95.5%，其可信度也達到73.0%、80.0%。

2.4.2 分離株Npro進化樹構建 對BVDV-1 Npro的基因進行遺傳進化分析，其結果表明，BVDV XC分離株與BVDV-1m參考株ZM-95、TJ0801同在一個分支，其可信度達到99.0%(圖5)，核苷酸同源性分析表明，分離株與BVDV-1m參考株ZM-95、TJ0801同源性也是最大的，達到了94.4%、93.1%。

圖2 分離株5′-UTR RT-PCR擴增結果

圖3 分離株Npro RT-PCR擴增結果

圖4 BVDV XC株5'-UTR進化分析

圖5 BVDV XC株Npro進化分析

3 討論

BVDVs自20世紀80年代首次在我國報道以來[11]，在我國廣泛流行，部分牛場血清陽性率高達100%[12-13]。CP型與NCP型BVDVs均可引起牛只感染，但NCP 型是當前牛群中主要流行的生物型，唯有NCP能導致機體持續性感染[14]。由于本次試驗獲得的分離株BVDV-1 XC是臨床健康牛的血清樣品分離的NCP毒株，為研究BVDVs持續性感染致病機理奠定基礎。

采用熒光標記抗體對分離株進行抗原性檢測結果來看，在細胞漿內可以觀察到綠色熒光，這符合BVDVs在感染細胞漿內完成復制生物學特征[15]。采用本試驗所建立的免疫熒光試驗對分離株XC毒力進行測定，結果為10-5.9TCID50/0.2 mL，但其毒力在牛體致病力如何，有待動物實驗進一步研究。

BVDVs亞型分類方法主要依據病毒的5'-UTR、Npro、E2基因進行[16-18]，近3年來流行病學研究顯示，BVDVs在我國存在不同亞型。Yifei Lang等[19](2014)也發現，從我國部分地區分離到的毒株存在9種亞型(BVDV-1a，-1b，-1c，-1d，-1o，-1m，-1p，-1q 與 BVDV-2a)。Mingliang Deng等[20](2015)對我國8省臨床觀察健康的奶牛、肉牛、牦牛、水牛等1 379份血清樣品遺傳進化分析發現，牛群中主要有 BVDV-1b(33.06%)， BVDV-1m (49.19%)， BVDV-1u (17.74%)等4種亞型。 陳銳等[13](2016)發現，新疆散養肉牛中主要流行BVDV-1q和BVDV-1f，內蒙主要流行BVDV-1m，甘肅流行的是一種新的亞型BVDV-1u。從這些研究報道不難看出，BVD-1m是我國目前主要流行的一種亞型。

本試驗為了確定分離株亞型，對分離株5'-UTR、Npro兩個基因核苷酸序列構建進化樹分析，結果顯示，分離株XC的這兩種不同基因序列均與BVDV-1m參考株在同一分支。核苷酸同源性分析，發現分離與BVDV-1m參考株的同源型均高于與BVDV-1其他參考株，進一步證實分離株XC屬于BVDV-1m亞型。

[1] Adams M, Hendrickson R, Dempsey D,etal. Tracking the changes in virus taxonomy [J]. Archives of virology, 2015, 160(5): 1 375-1 383.

[2] Liu L, Xia H, Wahlberg N,etal.classification and evolutionary insights into pestiviruses [J]. Virology, 2009, 385(2): 351-357.

[4] Mao L, Li W, Yang L,etal. Primary surveys on molecular epidemiology of bovine viral diarrhea virus 1 infecting goats in Jiangsu province, China [J]. BMC Veterinary Research, 2016, 12(1): 181.

[5] Vilcek S, Durkovic B, Kolesárová M,etal. Genetic diversity of international bovine viral diarrhoea virus (BVDV) isolates: identification of a new BVDV-1 genetic group [J]. Veterinary research, 2004, 35(5): 609-615.

[6] Scherer C, Flores E, Weiblen R,etal. Experimental infection of pregnant ewes with bovine viral diarrhea virus type-2 (BVDV-2): effects on the pregnancy and fetus [J]. Veterinary Microbiology, 2001, 79(4): 285-299.

[7] Tao J, Wang Y, Wang J,etal. Identification and genetic characterization of new bovine viral diarrhea virus genotype 2 strains in pigs isolated in China [J]. Virus genes, 2013, 46(1): 81-87.

[8] Shi H, Kan Y, Yao L,etal. Identification of Natural Infections in Sheep/Goats with HoBi‐like Pestiviruses in China [J]. Transboundary and Emerging Diseases, 2016, 63(5): 480-484.

[9] 鄧宇, 藺濤, 張榮, 等. 豬源牛病毒性腹瀉病毒套式 PCR 檢測方法的建立 [J]. 中國獸醫學報, 2012, 32(005): 654-657.

[10] Kim S G, Anderson R R, Jin Z Y,etal. Genotyping and phylogenetic analysis of bovine viral diarrhea virus isolates from BVDV infected alpacas in North America [J]. Veterinary microbiology, 2009, 136(3): 209-216.

[11] 李佑民, 劉振潤. 吉林省某奶牛場暴發牛病毒性腹瀉——粘膜病及其病毒分離的初步研究 [J]. 中國獸醫學報, 1981,1( 3): 62-64.

[12] 王淑娟, 王華, 宋曉暉, 等. 牛病毒性腹瀉/黏膜病的診斷流行病學調查及防控 [J]. 中國獸醫雜志, 2014,51(3): 38-40.

[13] 陳銳, 范學政, 朱元源, 等. 西部散養肉牛病毒性腹瀉病毒流行及遺傳變異 [J]. 中國農業科學, 2016, 49(13): 2 634-2 641.

[14] Peterhans E, Bachofen C, Stalder H,etal. Cytopathic bovine viral diarrhea viruses (BVDV): emerging pestiviruses doomed to extinction [J]. Veterinary research, 2010, 41(6): 44.

[15] 王新華, 劉守仁, 張榮興, 等. 牛病毒性腹瀉病毒侵染宿主細胞的電鏡觀察 [J]. 畜牧獸醫學報, 2002, 33(5): 501-503.

[16] Ridpath J, Bolin S, Dubovi E. Segregation of bovine viral diarrhea virus into genotypes [J]. Virology, 1994, 205(1): 66-74.

[17] Booth R E, Thomas C J, El-Attar L M,etal.A phylogenetic analysis of Bovine Viral Diarrhoea Virus (BVDV) isolates from six different regions of the UK and links to animal movement data [J]. Veterinary research, 2013, 44(1): 43.

[18] Tajima M, Frey H-R, Yamato O,etal. Prevalence of genotypes 1 and 2 of bovine viral diarrhea virus in Lower Saxony, Germany [J]. Virus research, 2001, 76(1): 31-42.

[19] Lang Y, Gao S, Du J,etal. Polymorphic genetic characterization of E2 gene of bovine viral diarrhea virus in China [J]. Veterinary microbiology, 2014, 174(3): 554-559.

[20] Deng M, Ji S, Fei W,etal. Prevalence study and genetic typing of bovine viral diarrhea virus (BVDV) in four bovine species in China [J]. PloS one, 2015, 10(4): e 0121718.

IsolationandIdentificationofBovineViralDiarrheaVirusXCStrain

DENG Yu , HE Xue-qian , CHEN Hong-jun , ZHANG Zheng

(School of Animal Sicience, Xichang Colleg, Xichang 615013，China)

A BVDV positive sample was propagated in MDBK cells and a BVDV strain was isolated. In this study, cell culture, direct immunofluorescence assay, RT-PCR and TCID50were applied to identify the isolate, and the bioinformatics software was used to analyze the genetic characteristics. Our results indicated that the strain did not cause cytopathic effect(CPE)until the tenth passage on MDBK cells. This isolate infected MDBK cells and showed strong fluorescent signal by the immunofluorescence assay. DNA fragment of 310 bp and 504 bp were amplified by PCR from 5'-UTR and Nproof this isolate. Virus titer of the isolate was 10-5.9TCID50/0.2mL. The homology comparison and phylogenetic analysis of 5'-UTR and Nprobetween BVDV-1 XC strain and representative BVDVs showed that the isolate was in the same group with BVDV-1m. BVDV-1 XC strain is successfully isolated and belongs to BVDV-1m and has noncytopathic effect.

Bovine viral diarrhea virus ; isolation and identification ; direct immune-fluorescence assay ; noncytopathic

S852.65+3

A

0529-6005(2017)10-0038-04

2017-04-07

四川省教育廳自然科學重點項目(18ZA0523)；四川省科技廳科技支撐項目(2014NZ0113)；攀西動物疫病檢測與防控四川省高校重點實驗室基本科研業務經費項目(341B)

鄧宇(1978-)，男，副教授，博士，主要從事獸醫微生物及其分子生物學研究，E-mail：dengyu127@163.com