miRNA在頂復(fù)門原蟲感染中的作用機(jī)制

王臣榮 ， 許瑞勤 ， 王榮軍 ， 張龍現(xiàn)

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院 ， 河南 鄭州 450002)

miRNA在頂復(fù)門原蟲感染中的作用機(jī)制

王臣榮 ， 許瑞勤 ， 王榮軍 ， 張龍現(xiàn)

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院 ， 河南 鄭州 450002)

頂復(fù)門原蟲是一類專一性的細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，如瘧原蟲、弓形蟲和隱孢子蟲，嚴(yán)重危害人類和動(dòng)物的健康，而且給全球公共衛(wèi)生和畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。宿主通過啟動(dòng)免疫反應(yīng)、凋亡及自噬等一系列細(xì)胞反應(yīng)清除體內(nèi)寄生原蟲，而頂復(fù)門原蟲也形成了多種機(jī)制逃避宿主的識(shí)別和清除，如干擾宿主一些重要信號(hào)通路、調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子的產(chǎn)生、細(xì)胞周期及脂代謝等。宿主清除胞內(nèi)寄生原蟲和頂復(fù)門原蟲逃避機(jī)制的能力主要是通過改變基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，研究表明，微小RNA(microRNA, miRNA)可以調(diào)控基因的表達(dá)。miRNA最早是在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)，隨后越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)。miRNA是一種長度為18～25個(gè)核苷酸(nt)的非編碼RNA分子，通過與靶基因mRNA的3′端非編碼區(qū)(3′untranslate region，3′UTR)結(jié)合，在翻譯水平上抑制靶基因的表達(dá)。miRNA廣泛存在于各種細(xì)胞質(zhì)中且參與細(xì)胞的凋亡、炎癥因子釋放、細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)和疾病的發(fā)生發(fā)展等。隨著對(duì)miRNA研究的深入，miRNA被認(rèn)為是宿主-病原體相互作用的關(guān)鍵調(diào)控者。因此本文對(duì)宿主/頂復(fù)門原蟲miRNA在頂復(fù)門原蟲(重點(diǎn)介紹瘧原蟲、弓形蟲和隱孢子蟲)感染中的作用機(jī)制做一綜述。

1 宿主miRNA在頂復(fù)門原蟲感染中的作用機(jī)制

研究表明，頂復(fù)門原蟲(如瘧原蟲、弓形蟲和隱孢子蟲)感染會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞miRNA的改變[1-3]，然而宿主細(xì)胞miRNA的改變一方面由原蟲為了更好的繁殖而引起[4-6]，另一方面是由宿主為了清除胞內(nèi)的原蟲引起[1,7-9]，然而宿主miRNA的這些作用機(jī)制尚未完全被揭示，因此本文從宿主miRNA調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)、凋亡反應(yīng)、改變宿主細(xì)胞特性和細(xì)胞周期及靶向蟲體mRNA做一討論。

1.1 宿主miRNA調(diào)節(jié)宿主對(duì)頂復(fù)門原蟲的免疫反應(yīng) 弓形蟲和隱孢子蟲都是機(jī)會(huì)性致病原蟲，瘧原蟲雖然不是機(jī)會(huì)性致病原蟲，但是機(jī)體免疫對(duì)瘧原蟲、弓形蟲和隱孢子蟲的清除至關(guān)重要。當(dāng)機(jī)體免疫低下或者缺失時(shí)，弓形蟲緩殖子變?yōu)樗僦匙樱从陕愿腥镜郊毙愿腥荆[孢子蟲會(huì)導(dǎo)致宿主出現(xiàn)致死性水瀉，而且寄生部位可能由小腸擴(kuò)大到膽管及肺部。研究表明，隱孢子蟲感染的小腸上皮細(xì)胞分泌CXCL10和IL-18(IFN-γ誘導(dǎo)因子)，而IFN-γ在固有免疫和特異性免疫反應(yīng)中都起著重要的作用。也有研究報(bào)道，小腸上皮細(xì)胞會(huì)分泌IFN-γ，分泌的IFN-γ會(huì)刺激巨噬細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生NO抵抗隱孢子蟲的感染。IFN-γ也可以激活NF-κB促進(jìn)TNF-α的轉(zhuǎn)錄。在感染微小隱孢子蟲的艾滋病人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了高水平的特異性的IgG/IgA，表明B細(xì)胞產(chǎn)生的特異性抗體在抗隱孢子蟲感染中可能不是必需的。綜上，表明機(jī)體的固有免疫和特異免疫對(duì)抗隱孢子蟲的感染非常重要。

研究發(fā)現(xiàn)，微小隱孢子蟲感染導(dǎo)致人膽管上皮細(xì)胞let-7家族miRNA下調(diào)，引起其靶基因SNAP3、TLR4及SIRT1上調(diào)。微小隱孢子蟲感染導(dǎo)致TLR4信號(hào)通路激活，進(jìn)一步激活I(lǐng)KK2，然后使SNAP3磷酸化，而SNAP3磷酸化會(huì)導(dǎo)致含抗菌肽的外泌體釋放，這些外泌體與微小隱孢子蟲子孢子結(jié)合降低子孢子的生存能力和感染能力，SIRT1上調(diào)會(huì)抑制NF-κB的激活[8,10-11]，因此let-7家族的下調(diào)在調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞免疫方面具有雙向性。Zhou等[7]發(fā)現(xiàn)，微小隱孢子蟲感染導(dǎo)致人膽管上皮細(xì)胞的miR-27b上調(diào)，引起其靶基因?yàn)镵SRP下調(diào)，進(jìn)而增加NO的產(chǎn)生來抵制隱孢子蟲的感染，后又發(fā)現(xiàn)，人膽管上皮細(xì)胞miR-424和miR-503下調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致其靶基因CX3CL1的上調(diào)來抵抗微小隱孢子蟲的感染[12]。Gong等[13]發(fā)現(xiàn)，微小隱孢子蟲感染導(dǎo)致人膽管上皮細(xì)胞的miR-221下調(diào)，導(dǎo)致其靶基因ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞的相互作用。Cannella等[14]發(fā)現(xiàn)，小鼠的腦組織中發(fā)現(xiàn)由弓形蟲分泌的ROP16引起miR-146a上調(diào)，而miR-146a會(huì)抑制IFN-γ的產(chǎn)生，進(jìn)而有利于弓形蟲的繁殖。Cai等[6]發(fā)現(xiàn)，弓形蟲感染導(dǎo)致人巨噬細(xì)胞miR-17-92上調(diào)，而miR-17-92是調(diào)節(jié)Th1型反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控者，其中包括促進(jìn)增殖、抑制凋亡、IFN-γ的產(chǎn)生和抑制T細(xì)胞分化[15]。

綜上，表明宿主miRNA主要通過直接或間接調(diào)控抗菌分子、細(xì)胞因子、趨化因子、粘附分子和細(xì)胞外泌體等一系列分子來調(diào)節(jié)宿主對(duì)頂復(fù)門原蟲的免疫反應(yīng)，或者有利于宿主清除寄生原蟲，或者有利于原蟲的繁殖。

1.2 宿主miRNA調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的凋亡反應(yīng) 研究表明，宿主細(xì)胞凋亡反應(yīng)是抗寄生蟲感染的一種經(jīng)典策略，然而頂復(fù)亞門原蟲也可以調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的凋亡，有利于自身的繁殖。通過微陣列技術(shù)分析微小隱孢子蟲和人隱孢子蟲感染HCT-8細(xì)胞早期的基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)由NF-κB調(diào)控的基因OPG(骨保護(hù)素)的上調(diào)，OPG阻止TRAIL(腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體)的促凋亡機(jī)制，抑制細(xì)胞凋亡有利于隱孢子蟲早期的繁殖。Liu等[16]利用微小隱孢子蟲感染HCT-8細(xì)胞，通過細(xì)胞核形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)，發(fā)現(xiàn)微小隱孢子蟲感染早期HCT-8細(xì)胞的凋亡被抑制，感染后期促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可能前期抑制凋亡有利于微小隱孢子蟲的繁殖，后期促進(jìn)細(xì)胞凋亡有利于微小隱孢子蟲的釋放。

研究表明，不同感染階段的原蟲通過調(diào)控宿主miRNA間接調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡[6,17-19]。微小隱孢子蟲早期感染導(dǎo)致人膽管上皮細(xì)胞miR-513下調(diào)，其靶基因B7-H1上調(diào)，進(jìn)而抑制感染的細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)未感染的細(xì)胞凋亡[17]，這可能是微小隱孢子蟲躲避免疫清除的一個(gè)策略。弓形蟲感染導(dǎo)致人巨噬細(xì)胞STAT3磷酸化進(jìn)而引起miR-17-92的上調(diào)，導(dǎo)致其靶基因Bim的下調(diào)，進(jìn)而抑制細(xì)胞的凋亡，有利于弓形蟲的繁殖[6,18-19]。

1.3 宿主miRNA可能改變宿主細(xì)胞特性及細(xì)胞周期 研究表明，宿主細(xì)胞特性和細(xì)胞周期在頂復(fù)門原蟲感染中也起著重要的調(diào)控作用。宿主為抵抗紅內(nèi)期瘧原蟲，正常的紅細(xì)胞突變?yōu)殓牭缎渭t細(xì)胞，第一可以增強(qiáng)單核細(xì)胞的吞噬能力，第二可以導(dǎo)致宿主肌動(dòng)蛋白重構(gòu)。通過改變紅細(xì)胞的表面特性，如紅內(nèi)期瘧原蟲分泌惡性瘧原蟲紅細(xì)胞表面蛋白-1(pfEMP-1)到紅細(xì)胞表面，進(jìn)而導(dǎo)致感染的紅細(xì)胞特異的和內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，進(jìn)而導(dǎo)致微循環(huán)局部堵塞導(dǎo)致炎癥及缺氧等一系列病理現(xiàn)象。紅細(xì)胞脫水或細(xì)胞密度的增加和紅內(nèi)期瘧原蟲的入侵有關(guān)。

研究表明，宿主miRNA可能改變宿主細(xì)胞周期。弓形蟲感染L6細(xì)胞導(dǎo)致含有miRNA的外泌體釋放，生物信息學(xué)分析這些外泌體miRNA參與細(xì)胞的繁殖和細(xì)胞周期，推測可能是由于這些外泌體miRNA抑制感染的細(xì)胞繁殖，增強(qiáng)未感染的細(xì)胞處在S期，而處在S期的細(xì)胞更有利于弓形蟲的入侵[20]，可能S期的細(xì)胞可以更好地提供弓形蟲的合成DNA所需的材料。

1.4 宿主miRNA靶向頂復(fù)門原蟲mRNA 研究表明，宿主miRNA可以靶向病毒mRNA。宿主細(xì)胞miR-323，miR-491和miR-654能靶向A型流感病毒PB1基因進(jìn)而抑制H1N1流感病毒在MDCK細(xì)胞中的復(fù)制。let-7c可靶向A型流感病毒M基因，進(jìn)而抑制流感病毒在A549細(xì)胞內(nèi)的增殖。

受到宿主miRNA可以靶向病毒的mRNA的啟示，宿主miRNA或許可以靶向頂復(fù)門原蟲的mRNA，進(jìn)而抑制頂復(fù)門原蟲的繁殖。瘧原蟲感染致紅細(xì)胞let-7i、miR-451及miR-223上調(diào)，進(jìn)而靶向抑制瘧原蟲PKA-R的表達(dá)，進(jìn)而來抵抗瘧原蟲的感染[9]，這也說明了宿主細(xì)胞內(nèi)的miRNA來源不局限于細(xì)胞核。病毒和頂復(fù)門原蟲的入侵過程不一樣，病毒將核酸注入細(xì)胞內(nèi)，因此宿主細(xì)胞miRNA可以很容易靶向病毒的mRNA，而頂復(fù)門原蟲會(huì)形成納蟲空泡并且原蟲以二分裂方式繁殖，因此宿主miRNA進(jìn)入頂復(fù)門原蟲子孢子中非常困難，或許外泌體非編碼RNA比較容易。因此須進(jìn)一步驗(yàn)證宿主miRNA是否可以靶向頂復(fù)門原蟲mRNA。

除上述作用機(jī)制外，宿主miRNA可能參與宿主細(xì)胞/頂復(fù)門原蟲的自噬過程。研究表明，弓形蟲和瘧原蟲體內(nèi)存在自噬現(xiàn)象，當(dāng)子孢子成功入侵宿主細(xì)胞后，不再需要參與子孢子粘附和入侵的細(xì)胞器，如微線體和棒狀體，因此蟲體會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞自噬途徑清除這些細(xì)胞器，以便獲取的能量更多的用于裂殖生殖。非頂復(fù)門利什曼原蟲感染引起宿主細(xì)胞miRNA表達(dá)譜改變，而一些miRNA調(diào)控宿主細(xì)胞抗利什曼原蟲感染的自噬過程[21-22]。宿主細(xì)胞miRNA是否也可以介導(dǎo)細(xì)胞抗頂復(fù)門原蟲感染的自噬過程，需要進(jìn)一步研究。

2 頂復(fù)門原蟲miRNA在頂復(fù)門原蟲感染中的作用機(jī)制

研究表明，瘧原蟲自身基因組中不含miRNA，而且缺乏Dicer和Argonaute核心酶[23]。隱孢子蟲全基因組分析無編碼Dicer和Argonaute蛋白的序列，也無發(fā)現(xiàn)同系物[24]，即隱孢子蟲中無產(chǎn)生miRNA所必須的酶，因此隱孢子蟲體不表達(dá)miRNA，而國內(nèi)研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)了微小隱孢子蟲miRNA[25-26]，因此文獻(xiàn)報(bào)道微小隱孢子蟲表達(dá)miRNA值得商榷。弓形蟲體內(nèi)檢測到miRNA[27-29]。

研究表明，頂復(fù)門原蟲miRNA靶向宿主細(xì)胞mRNA。病毒miRNA也可以靶向宿主mRNA，如HCMV miR-UL112可能靶向MICB，導(dǎo)致MICB特異性下調(diào)最終導(dǎo)致NK細(xì)胞的殺傷作用下降。受到病毒的啟示，是否弓形蟲miRNA也可以靶向宿主mRNA？Sa?ar等[30]利用生物信息學(xué)分析弓形蟲miRNA很有可能進(jìn)入宿主細(xì)胞并調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)。因此頂復(fù)原蟲miRNA直接或間接影響宿主基因的表達(dá)還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 小結(jié)與展望

綜上，頂復(fù)門原蟲感染會(huì)引起宿主miRNA改變，而這些改變的miRNA并不完全是由頂復(fù)門原蟲特異引起的；宿主miRNA的改變可以調(diào)控宿主對(duì)頂復(fù)門原蟲的免疫反應(yīng)、凋亡反應(yīng)、細(xì)胞周期及頂復(fù)門原蟲基因，而頂復(fù)門原蟲miRNA也可以調(diào)控宿主基因。在miRNA水平上，國外關(guān)于頂復(fù)門原蟲尤其為瘧原蟲、弓形蟲和隱孢子蟲與宿主之間相互作用機(jī)制的研究并不多，并且主要是關(guān)于miRNA對(duì)宿主免疫反應(yīng)的研究，而在miRNA水平上，國內(nèi)對(duì)頂復(fù)門原蟲-宿主相互作用機(jī)制的研究更少，并且主要是頂復(fù)門原蟲感染對(duì)宿主miRNA的影響[2,6,18,25-26,31]和不同基因型/不同生殖階段頂復(fù)門原蟲miRNA的改變[32-33]，只是初步研究。

目前關(guān)于研究宿主/頂復(fù)門原蟲非編碼RNA的研究存在著一些問題，(1)哪些宿主細(xì)胞非編碼RNA是由特定寄生蟲引起的？(2)同一屬不同種原蟲甚至同一種不同亞型的原蟲導(dǎo)致宿主非編碼RNA表達(dá)譜是否完全一樣？(3)頂復(fù)門感染不同宿主細(xì)胞引起的宿主/頂復(fù)門原蟲非編碼RNA的變化是否完全不一樣？(4)不同感染階段對(duì)宿主/頂復(fù)門原蟲非編碼RNA的影響，不同感染劑量對(duì)宿主非編碼RNA的影響的研究太少；(5)過多的關(guān)注宿主非編碼RNA引起的下游反應(yīng)，而是什么原因造成宿主非編碼RNA的改變知之甚少，可能由于頂復(fù)門原蟲分泌的蛋白造成，也可能宿主細(xì)胞通過模式識(shí)別受體，如TLR的識(shí)別引起宿主非編碼RNA的改變；(6)其他非編碼RNA，如lncRNA和circRNA，及l(fā)ncRNA和circRNA與miRNA的相互關(guān)系的研究太少；(7)目前大多數(shù)研究宿主細(xì)胞-頂復(fù)門原蟲相互作用機(jī)制都是通過體外試驗(yàn)，不能真正的表現(xiàn)機(jī)體內(nèi)宿主細(xì)胞-頂復(fù)門原蟲相互作用機(jī)制。

相信隨著對(duì)頂復(fù)門原蟲及感染宿主細(xì)胞miRNA研究的不斷深入，我們可以更清楚哪些miRNA是特異的頂復(fù)門原蟲引起的，為頂復(fù)門原蟲病提供診斷標(biāo)記；哪些miRNA有利于頂復(fù)門原蟲的入侵；哪些miRNA有利于宿主清除頂復(fù)門原蟲；哪些miRNA是平衡頂復(fù)門原蟲寄生與宿主細(xì)胞抗寄生，為研發(fā)抗頂復(fù)門原蟲藥物及疫苗提供新靶標(biāo)。

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S855.9+9

A

0529-6005(2017)10-0073-04

2017-05-14.

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31672548)和重點(diǎn)項(xiàng)目(30600603)

王臣榮(1985-)，男，碩士生，主要從事人獸共患寄生蟲學(xué)研究，E-mail: 1203431811@qq.com

張龍現(xiàn)，E-mail：zhanglx8999@henau.edu.cn