不同化療方案對多發性骨髓瘤患者T細胞亞群及相關細胞因子水平的影響

宋麗麗，張 日，潘迎英?，郜 曉

（1.張家港市中醫醫院腫瘤血液科，江蘇 張家港 215600；2.蘇州大學附屬第一醫院血液科，江蘇 蘇州 215000）

不同化療方案對多發性骨髓瘤患者T細胞亞群及相關細胞因子水平的影響

宋麗麗1，張 日2，潘迎英?1，郜 曉1

（1.張家港市中醫醫院腫瘤血液科，江蘇 張家港 215600；2.蘇州大學附屬第一醫院血液科，江蘇 蘇州 215000）

目的：探討不同化療方案對多發性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）患者T淋巴細胞亞群和相關細胞因子水平的影響。方法：將2011年6月至2013年12月期間張家港市中醫醫院腫瘤血液科收治的60例MM患者隨機分為硼替-地塞組（30例）和VAD-沙利組（30例）。為硼替-地塞組患者采用VD方案（硼替佐米+地塞米松）進行化療，為VAD-沙利組患者聯合應用改良的VAD方案（長春新堿+表柔比星+地塞米松）和沙利度胺進行化療，并對比兩組患者治療的效果及治療前后其調節性T細胞(Regulatory T cells,Treg)、輔助性T細胞17(T helper cell 17,Th17)、IL-6（白細胞介素-6）、IL-17（白細胞介素-17）和TGF-β（轉化生長因子-β）的水平。結果：硼替-地塞組患者治療的總有效率高于VAD-沙利組患者，治療后其Treg的水平高于VAD-沙利組，其TH17、IL-6、IL-17的水平低于VAD-沙利組，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論：與聯合應用改良的VAD方案和沙利度胺相比，用VD方案治療MM的臨床效果更好。

多發性骨髓瘤；硼替佐米；沙利度胺；細胞因子；輔助性T細胞17；調節性T細胞

多發性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是一種血液系統惡性腫瘤。此病的發病原因主要是患者骨髓中的漿細胞發生異常的克隆性增生[1]。臨床研究發現[2]，MM患者的血液循環中常存在T淋巴細胞與細胞因子的異常表達，前者主要包括調節性T細胞(Regulatory T cells,Treg)和輔助性T細胞17(T helper cell 17,Th17)等，后者主要包括白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白細胞介素-17(interleukin-17,IL-17)和轉化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)等。相關的臨床研究證實，Treg與Th17的水平與

MM的發生、發展密切相關。為了對比用VD方案與聯合應用改良的VAD方案和沙利度胺治療MM的臨床效果，筆者對張家港市中醫醫院腫瘤血液科收治的60例MM患者進行了對照研究。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象的納入標準

病情符合《血液病診斷及療效標準》（第三版）中規定的MM的診斷標準。2）Durie-Salmon分期為Ⅰ期、Ⅱ期或Ⅲ期。

1.2 研究對象的臨床資料

選取2011年6月至2013年12月期間張家港市中醫醫院腫瘤血液科收治的60例MM患者。將這60例患者隨機分為硼替-地塞組（30例）和VAD-沙利組（30例）。硼替-地塞組患者中有男24例，女6例；其年齡在58歲至72歲之間，平均年齡（64.2±3.7）歲；其中Durie-Salmon分期為Ⅰ期的患者有5例，為Ⅱ期的患者有18例，為Ⅲ期的患者有7例；其中血中M蛋白類型為IgG型的患者有12例，為IgA型的患者有8例，為IgM型的患者有5例，為輕鏈型的患者有5例。VAD-沙利組患者中有男23例，女7例；其年齡在58歲至70歲之間，平均年齡（63.1±2.6）歲；其中Durie-Salmon分期為Ⅰ期的患者有6例，為Ⅱ期的患者有18例，為Ⅲ期的患者有6例；其中血中M蛋白類型為IgG型的患者有14例，為IgA型的患者有6例，為IgM型的患者有3例，為輕鏈型的患者有7例。兩組患者的一般臨床資料相比差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.3 治療方法

為硼替-地塞組患者采用VD方案進行化療。具體的化療方法是：1）在對患者進行化療的第1天、第4天、第8天、第11天，使用1.3 mg/m2的硼替佐米（商品名：萬珂，由西安楊森制藥有限公司生產）對其進行靜脈推注，1次/d。2）在對患者進行化療的第1天、第2天、第4天、第5天、第8天、第9天、第11天、第12天，使用20 mg/m2的地塞米松對其進行靜脈滴注，1次/d。3）治療28天為1個周期，應連續治療2個周期。為VAD-沙利組患者聯合應用改良的VAD方案和沙利度胺進行化療。具體的化療方法是：1）讓患者口服沙利度胺（商品名：反應停，由常州制藥廠有限公司生產）進行治療，開始用藥時每天服100 mg。然后，根據患者的耐受情況逐漸為其增加用藥量（每周最多增加50 mg），直至用藥量達到200 mg/d。2）將0.5 mg的長春新堿加入到20 ml的生理鹽水中，對患者進行靜脈注射，1次/d。用藥時間為對患者進行化療的第1天和第4天。3）將l0 mg的表柔比星加入到20 ml的生理鹽水中，對患者進行靜脈注射，1次/d。用藥時間為對患者進行化療的第1天和第4天。4）將40 mg的地塞米松加入到250 ml的生理鹽水中，對患者進行靜脈滴注，1次/d。用藥時間為對患者進行化療的第1天、第2天、第3天、第4天、第9天、第10天、第11天、第12天、第17天、第18天、第19天、第20天。5）治療28天為1個周期，應連續治療2個周期。

1.4 檢測設備和試劑

1.4.1 檢測設備 本次研究所用的檢測設備主要包括：1）1.5 ml的微量離心管、2 ml的微量離心管、移液器和微量高速離心機（均由Eppendorf公司生產）。2）超凈工作臺（由蘇州凈化設備儀器廠生產）。3）37 ℃恒溫箱（由福意聯恒溫箱公司生產）。4）550酶標儀（由Bio-rad公司生產）。5）COBAS INTEGRA 400 Plus型全自動生化分析儀（由Roche公司生產）。6）MDF-328E型低溫冰箱（由日本三洋公司生產）。7）FACS Calibur型流式細胞儀（由美國Becton Dickinson公司生產）。

1.4.2 檢測試劑 本次研究所用的檢測試劑主要包括：1）CD3/CD4/CD8單克隆抗體、CD4/ CD25單克隆抗體、鼠抗人Foxp3型單克隆抗體、CD3單克隆抗體、CD8單克隆抗體、IL-17A單克隆抗體、同型對照IgG2a和同型對照IgG1（均由美國Becton Dickinson公司生產）。2）IL-6檢測試劑盒和IL-17檢測試劑盒（均由上海拜力生物科技有限公司生產）。3）TGF-β檢測試劑盒（由上海富眾生物科技發展有限公司生產）。

1.5 檢測方法

1.5.1 進行Treg檢測和Th17檢測的方法 采用流式細胞技術對兩組患者Treg、Th17的水平進行檢測。進行Treg檢測的方法是：1）取兩支流式管，分別標記為測定管和同型對照管。2）在這兩支流式管中均加入20μl的 CD4-FITC抗體。然后，將5μl的CD25-APC抗體加入到測定管中，并將等量的同型抗體加入到同型對照管中。3）在測定管和同型對照管中分別加入受檢者的細胞懸液100μl，避光孵育30 min。孵育結束后，用PBS緩沖液對這兩支流式管中的細胞懸液進行離心洗滌，然后棄去上清液。4）在這兩支流式管中加入固定液和破膜液，避光孵育30min。孵育結束后，用PBS緩沖液重懸細胞。5）將20μl的Foxp3-PE抗體加入到測定管中，并將等量的同型抗體加入到同型對照管中，避光孵育30 min。孵育結束后，用PBS緩沖液對細胞懸液進行離心洗滌，然后棄去上清液。6）使用0.3ml的PBS緩沖液重懸細胞，然后使用流式細胞儀對流式管中Treg的含量進行檢測。進行TH17檢測的方法是：1）取兩支流式管，分別標記為測定管和同型對照管。2）在這兩支流式管中均加入受檢者的細胞懸液100μl。然后，將20μl的CD4抗體（FITC標記）和5 μl的CD3抗體（APC標記）加入到測定管中，將等量的同型抗體加入到同型對照管中，避光孵育30min。3）孵育結束后，用PBS緩沖液對這兩支流式管中的細胞懸液進行離心洗滌。棄去上清液后，用PBS緩沖液重懸細胞，并對細胞懸液進行細胞染色。4）將染色后的細胞懸液加入到培養板中，按標準工作濃度依次加入佛波酯、離子霉素和含莫能霉素的Golgistop蛋白轉運抑制劑，吹打混勻后將培養板置于細胞培養箱內培養5h。5）將培養后的細胞懸液重新置于測定管和同型對照管中，并在這兩支流式管中均加入固定液和破膜液，避光孵育30min。孵育結束后，使用PBS緩沖液對細胞懸液進行離心洗滌。棄去上清液后，使用PBS緩沖液重懸細胞。6）將20μl的IL-17-PE抗體加入到測定管中，并將等量的同型抗體加入到同型對照管中，避光孵育30 min。孵育結束后，用PBS緩沖液對細胞懸液進行離心洗滌，然后棄去上清液。7）使用0.3 ml的PBS緩沖液重懸細胞，然后使用流式細胞儀對流式管中TH17的含量進行檢測。

1.5.2 進行IL-6、IL-17和TGF-β檢測的方法 采用ELISA雙抗體夾心法對兩組患者IL-6、IL-17和TGF-β的水平進行檢測（嚴格按照試劑盒操作說明書中規定的實驗步驟進行實驗操作）。

1.6 觀察指標

觀察并對比兩組患者治療的效果及治療前后其Treg、Th17、IL-6、IL-17和TGF-β的水平。

1.7 療效評定標準

CR（完全緩解）：患者的腫瘤病灶消失。2）PR（部分緩解）：患者的腫瘤病灶縮小50%以上。3）MR（微效）：患者的腫瘤病灶縮小25%至50%。4）NC（穩定）：患者的腫瘤病灶縮小不足25%。5）PD（進展）：患者的腫瘤病灶未縮小，甚至在增大。

1.8 統計學分析

采用SPSS 13.0統計軟件對研究數據進行統計學處理，患者Treg、Th17、IL-6、IL-17和TGF-β的水平用（±s）表示，采用t檢驗，治療的總有效率用%表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者治療效果的比較

硼替-地塞組患者中治療效果為CR的患者有10例（占33.3%），為PR的患者有7例（占23.3%），為MR的患者有2例（占6.7%），為NC的患者有9例（占30.0%），為PD的患者有2例（占6.7%）。硼替-地塞組患者治療的總有效率為93.3%（28/30）。VAD-沙利組患者中治療效果為CR的患者有3例（占10.0%），為PR的患者有11例（占36.7%），為MR的患者有1例（占3.3%），為NC的患者有5例（占16.7%），為PD的患者有10例（占33.3%）。VAD-沙利組患者治療的總有效率為66.7%（20/30）。與VAD-沙利組患者相比，硼替-地塞組患者治療的總有效率更高，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 治療前后兩組患者Treg、Th17水平的比較

在進行治療前，兩組患者Treg、Th17的水平相比差異無統計學意義（P＞0.05）。經過2個周期的化療后，兩組患者Treg的水平均較治療前明顯升高，其Th17的水平均較治療前明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。與VAD-沙利組患者相比，硼替-地塞組患者Treg水平升高的幅度和Th17水平降低的幅度均更大，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表2。

2.3 治療前后兩組患者IL-6、IL-17和TGF-β水平的比較

在進行治療前，兩組患者IL-6、IL-17和TGF-β水平相比差異無統計學意義（P＞0.05）。經過2個周期的化療后，兩組患者IL-6、IL-17和TGF-β水平均較治療前明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。與VAD-沙利組患者相比，硼替-地塞組患者IL-6水平和IL-17水平降低的幅度均更大，差異有統計學意義（P＜0.05）。兩組患者TGF-β水平降低的幅度相比差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表3。

表1 兩組患者治療效果的比較

表2 治療前后兩組患者Treg、Th17水平的比較 （ %，±s）

表2 治療前后兩組患者Treg、Th17水平的比較 （ %，±s）

注：▲與治療后比較，差異具有統計學意義，P＜0.05；△與VAD-沙利組比較，差異具有統計學意義，P＜0.05。

組別 例數 Treg的水平 Th17的水平治療前 治療后 治療前 治療后硼替-地塞組 30 3.48±1.20▲ 4.87±1.32△ 2.67±0.93▲ 1.73±0.91△VAD-沙利組 30 3.46±1.27▲ 4.35±1.22 2.64±0.97▲ 2.04±0.90

表3 治療前后兩組患者IL-6、IL-17和TGF-β水平的比較 （ ±s）

表3 治療前后兩組患者IL-6、IL-17和TGF-β水平的比較 （ ±s）

注：▲與硼替-地塞組比較，差異具有統計學意義，P＜0.05；△與治療前比較，差異具有統計學意義，P＜0.05。

組別 例數 IL-6(pg/ml) IL-17(pg/ml) TGF-β(ng/ml)治療前 治療后 治療前 治療后 治 療前 治療后硼替-地塞組 30 17.82±3.56 6.73±1.77△ 48.33±5.64 19.41±3.84△ 21.87±3.73 9.07±2.45△VAD-沙利組 30 17.14±3.48 8.15±1.90▲△ 48.25±5.57 23.27±3.91▲△ 21.29±3.84 8.83±2.75△

3 討論

MM是一種血液系統惡性腫瘤。此病的發病機制十分復雜。有研究指出，MM的發生、發展與電離輻射、慢性抗原刺激、免疫功能紊亂、EB病毒或皰疹病毒感染誘發的C-MYC、N-RAS、K-RAS或H-RAS密切相關。

Treg是一種同時具有免疫無能和免疫抑制兩大特性的T細胞亞群。臨床研究發現，MM患者Treg的水平與其病情的嚴重程度密切相關[3]。Th17是一種以分泌IL-17為主要特征的T細胞亞群。Schmidmaier H等[4]在臨床研究中應用流式細胞儀對MM患者外周血及骨髓中Th17的水平進行檢測。研究結果顯示，MM患者外周血及骨髓中Th17的水平均明顯高于正常人。

IL-6是一種細胞因子，具有刺激初始CD4+T細胞向Th17分化的作用[5]。有研究指出，MM患者IL-6的水平明顯高于正常人，且其IL-6的水平與其病情的嚴重程度密切相關[6]。Fulciniti M等[7]指出，IL-6是促進骨髓瘤細胞生長的關鍵因子。

IL-17是Th17的主要效應分子。2006年，Alexandrakis MG等[8]通過臨床研究發現，MM患者IL-17的水平明顯高于正常人，且其IL-17的水平與其病情的嚴重程度密切相關。TGF-β是一種具有調節細胞生長和分化作用的細胞因子[9]。研究發現，幾乎所有的腫瘤細胞中都可以檢測到TGF-β的mRNA[10]。

硼替佐米、地塞米松、長春新堿、表柔比星、地塞米松和沙利度胺均為臨床上常用的抗腫瘤藥物[11]。硼替佐米(bortezomib)屬于氨基硼酸衍生物，其商品名為萬珂。此藥能夠有效地抑制轉錄因子NF-κB、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、血管內皮生長因子(VEGF)和IL-6的活性，降低骨髓基質細胞的粘附能力[12]。沙利度胺(Thalidomide)屬于谷氨酸衍生物，其商品名為反應停。此藥具有調節免疫細胞活性、抑制炎性細胞因子活性和誘導抗腫瘤免疫反應等作用，從而可有效地抑制骨髓瘤細胞的生長和增殖[13]。為了對比用VD方案（硼替佐米+地塞米松）與聯合應用改良的VAD方案（長春新堿+表柔比星+地塞米松）和沙利度胺治療MM的臨床效果，筆者將2011年6月至2013年12月期間張家港市中醫醫院腫瘤血液科收治的60例MM患者隨機分為硼替-地塞組和VAD-沙利組。為硼替-地塞組患者采用VD方案進行化療，為VAD-沙利組患者聯合應用改良的VAD方案和沙利度胺進行化療。治療結束后，對比兩組患者治療的效果及治療前后其Treg、Th17、IL-6、IL-17和TGF-β的水平。本次研究的結果顯示，硼替-地塞組患者治療的總有效率高于VAD-沙利組患者，治療后其Treg的水平高于VAD-沙利組，其TH17、IL-6、IL-17的水平低于VAD-沙利組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

綜上所述，與聯合應用改良的VAD方案和沙利度胺相比，用VD方案治療MM的臨床效果更好。

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R73

B

2095-7629-（2017）8-0064-04

宋麗麗，女，1983年12月出生，江蘇張家港人，主治醫師，碩士， 研究方向為血液疾病的診斷與治療

＊通訊作者：潘迎英