蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2調(diào)節(jié)香煙提取物誘導(dǎo)的肺上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

沈輝娟，蔣俊霞，李芬芬，謝強(qiáng)敏，顏小鋒

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院1.附屬第二醫(yī)院藥劑科,浙江 杭州 310009;2. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,浙江 杭州 310058)

肺癌和慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)影響人類生活質(zhì)量，發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢，是有必要關(guān)注的全球性健康問題。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是肺癌和COPD的重要病理生理過程[1]。吸煙是引起EMT的重要因素[2]，有研究證實，用香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract, CSE)刺激肺上皮細(xì)胞會增加IL-1α、IL-1β、IL-8、TNF-α、MMP-9 以及TGF-β1的表達(dá)[3-4]。然而，香煙所引起的EMT變化以及其潛在的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。Shp2是蛋白酪氨酸磷酸酶家族的一員，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、分化和代謝轉(zhuǎn)錄[5]。EMT是細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的一種重要形式，提示Shp2在EMT過程中可能也發(fā)揮調(diào)控作用。在過去的20多年里，轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)已逐漸被明確為最重要的EMT誘導(dǎo)因子，并且成為近年來的研究焦點[6]。有研究證明，Shp2在TGF-β1誘導(dǎo)的EMT中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，但其是否調(diào)節(jié)香煙誘導(dǎo)的肺泡EMT尚未見報道。在本研究中，我們初步探討Shp2在CSE誘導(dǎo)的EMT中的調(diào)節(jié)作用。

1 材料

1.1細(xì)胞株人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞株A549細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。

1.2藥物與試劑Shp2抑制劑苯基吡唑肼基磺酸鹽(phenylhydrazonopyrazolone sulfonate 1，PHPS1)購自美國Sigma公司；3R4F標(biāo)準(zhǔn)香煙購自美國肯塔基大學(xué)煙草研究所；熒光二抗購自LiCOR公司(批號: 926-32211)；兔抗人E-鈣黏蛋白 (E-cadherin)、波紋蛋白 (Vimentin)、α-肌動蛋白 (α-SMA)、 p-Smad2、Smad2均購自Cell Signaling公司；Shp2 siRNA購自上海吉瑪公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Hyclone公司；TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；其他制劑均為市售AR級試劑。

1.3儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱:美國Thermo公司；BX51顯微鏡: 日本Olympus公司；7300實時熒光定量PCR儀: 美國ABI公司；Biophotometer核酸蛋白紫外分光光度計: 德國Eppendorf公司；IX70倒置顯微鏡:日本OLYMPUS公司；AG22331核酸蛋白測定儀: 德國Eppendorf公司；酶標(biāo)儀: 美國ThermoFisher Scientific；Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng): 美國基因公司。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)A549細(xì)胞于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含2 mmol·L-1谷氨酰胺、10 kU·L-1青霉素、10 mg·L-1鏈霉素)中，37℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長情況，每2 d傳代1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

2.2CSE制備CSE的制備參考Baginski等[7]報道的方法并加以修改。收集3支實驗研究用的濾嘴香煙(3R4F標(biāo)準(zhǔn)香煙，每支焦油含量9.5 mg，尼古丁含量0.73 g)，用50 mL針筒抽吸入30 mL PBS中。香煙持續(xù)抽吸4 min。1支香煙抽吸完畢后，溶液用1 mol·L-1氫氧化鈉(市售分析純)調(diào)整pH值至7.2～7.4，然后經(jīng)含0.45 μm微孔濾膜的濾頭過濾除菌，在320 nm檢測吸光度定標(biāo)。CSE在-80℃保存，使用前應(yīng)快速解凍，30 min內(nèi)用于實驗。

2.3Q-PCR檢測TGF-β1的表達(dá)取指數(shù)生長期的A549細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以2×105個/瓶的密度接種于12.5 mL培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶80%以上，用PBS洗1次，徹底去除血清作用，換用0.1% BSA的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)過夜。藥物孵育 48 h后，提取細(xì)胞的mRNA，以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以GAPDH 上游序列:5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游序列:5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′作為內(nèi)參；用目的基因TGF-β1引物上游序列: 5′-CCAGGACGCCTTCTGCAAC-3′，下游序列: 5′-CCTCCTTTACCAGCTTCTTCCC-3′進(jìn)行熒光定量PCR分析。

2.4酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測A549細(xì)胞接種于12孔板，每孔培養(yǎng)基總量1 mL, 各組細(xì)胞于加藥刺激后留取細(xì)胞培養(yǎng)上清，分別用于檢測TGF-β1的蛋白表達(dá)。ELISA檢測細(xì)胞上清液中TGF-β1的蛋白含量，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.5免疫熒光染色A549細(xì)胞接種在蓋玻片上，放入12孔板中培養(yǎng)，各組細(xì)胞于加藥刺激后PBS洗3遍，棄PBS后加入4%多聚甲醛固定0.5 h。然后用0.1% (V/V) Triton X-100/PBS通透0.5 h， 1% BSA (W/V)/1% 正常血清(V/V)/PBS在常溫下封閉1 h。棄封閉液，孵一抗(1 ∶50，PBS稀釋)，4℃冰箱放置過夜，洗片，然后用熒光二抗(1 ∶200，PBS稀釋)在常溫下孵育2 h。洗片后DAPI染核。用50%甘油進(jìn)行封片，于共聚焦顯微鏡下觀察染色情況。

2.6Westernblot檢測將對數(shù)生長期的細(xì)胞，每孔106個接種于6孔板，藥物預(yù)處理0.5 h，加CSE刺激0.5 h后，收集細(xì)胞，裂解液裂解細(xì)胞，4℃、12 000 r·min-1離心10 min，獲得蛋白樣品。BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白變性后，30～50 ng蛋白樣品上樣，十二烷基硫酸鈉凝膠電泳2 h，濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗(1 ∶500)4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗(1 ∶5 000 HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，以O(shè)dyssey熒光掃描儀掃描，采用Quantity one軟件計算灰度比值。

2.7細(xì)胞Shp2基因轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，生長24 h后，根據(jù)說明書用Lipofectamine 2000試劑將攜帶Shp2 siRNA 序列(正義鏈5′-GAACAUCACGGCAAUUAAUU-3′，反義鏈5′-GAACACUGGUGAUUACUAUUU-3′)和空載體轉(zhuǎn)入到A549細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，用免疫印跡法檢測細(xì)胞中Shp2蛋白表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1CSE對Shp2表達(dá)及活性的影響為確定CSE對肺上皮細(xì)胞Shp2表達(dá)的影響，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞A549在2% CSE培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 h，Western blot結(jié)果顯示，與未處理空白組相比，CSE刺激組Shp2明顯過表達(dá)(Fig 1A)。CSE刺激A549細(xì)胞15 min后, Western blot法測定Shp2磷酸化水平，如Fig 1B顯示，CSE呈濃度依賴性誘導(dǎo)A549細(xì)胞Shp2磷酸化。

3.2PHPS1對CSE誘導(dǎo)的TGF-β1表達(dá)的影響PHPS1(20 μmol·L-1)預(yù)處理細(xì)胞0.5 h后，加2% CSE刺激細(xì)胞48 h后，采用Q-PCR和ELISA法測定TGF-β1 mRNA和蛋白的表達(dá)。Fig 2結(jié)果顯示，PHPS1抑制CSE誘導(dǎo)的TGF-β1 mRNA和蛋白的表達(dá)。

3.3PHPS1對CSE誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞形態(tài)的影響采用顯微鏡觀察PHPS1對CSE誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞形態(tài)的影響。結(jié)果顯示，與空白對照組相比(Fig 3A)，CSE刺激A549細(xì)胞48 h后，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變 (Fig 3B)。在加CSE刺激之前，PHPS1 (20 μmol·L-1)預(yù)處理30 min，能改善CSE誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)改變(Fig 3C)。而PHPS1 (20 μmol·L-1)單獨處理細(xì)胞對細(xì)胞的形態(tài)沒有明顯的影響 (Fig 3D)。

3.4PHPS1對CSE誘導(dǎo)的EMT的影響免疫熒光染色A549細(xì)胞，F(xiàn)ig 4結(jié)果表明，與空白對照組相比，2% CSE刺激組EMT相關(guān)因子E-cadherin表達(dá)(綠色熒光)減少，Vimentin和α-SMA表達(dá)增加；預(yù)先用PHPS1(20 μmol·L-1)處理能明顯增加E-cadherin表達(dá)，減少Vimentin和α-SMA表達(dá)。該結(jié)果提示抑制Shp2能有效減少CSE誘導(dǎo)EMT相關(guān)因子的表達(dá)。

Fig 1 Stimulation of CSE increases Shp2 level and phosphorylation in A549 cells (±s, n=4)

*P<0.05vsuntreated control group

3.5Shp2抑制減少CSE誘導(dǎo)的Smad2活性PHPS1(20 μmol·L-1)抑制Shp2的活性，然后用2% CSE刺激細(xì)胞0.5 h，Western blot法檢測Smad2的磷酸化。如Fig 5A所示，PHPS1明顯抑制CSE誘導(dǎo)的Smad2的激活。進(jìn)一步采用Shp2 siRNA抑制Shp2的表達(dá)，F(xiàn)ig 5B結(jié)果顯示，阻斷Shp2的表達(dá)可明顯抑制CSE誘導(dǎo)的Smad2的磷酸化。

4 討論

肺癌和COPD是常見病，在有些病人也是共患病[1]，晚期均有不同程度的肺纖維化[8]。肺纖維化發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，迄今為止尚未完全闡明。在COPD，EMT參與組織修復(fù)和重塑的過程會導(dǎo)致小氣道纖維化；在肺癌，EMT除了促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，也會引起肺纖維化[1]。

Fig 2 Inhibition of Shp2 reduces expression of TGF-β1 mRNA(A) and protein(B) induced by CSE in A549 cells(±s, n=4)

**P<0.01vsuntreated group;#P<0.05,##P<0.01vsCSE-stimulated group

Fig 3 Effect of PHPS1 on CSE-induced variation of cell morphology in A549 cells

A: Control; B: 2% CSE; C: 2% CSE + PHPS1; D: PHPS1

A: Representative photomicrographs demonstrating E-cadherin, Vimentin and α-SMA detected by immunofluorescence staining(scale bar: 200 μm). B:Fluorescent quantitative results.*P<0.05,**P<0.01vsuntreated group;#P<0.05vsCSE-stimulated cells.

Fig 5 Inhibition of Shp2 inhibitor(A) or Shp2 siRNA(B) alleviates Smad2 phosphorylation induced by CSE in A549 cells (±s, n=4)

Cell lysates were prepared, and then immunoblotted with antibodies for phospho-Smad2 phosphorylated at Ser465/467.*P<0.05vsuntreated group/negative control (NC) group;#P<0.05vs2% CSE group.

吸煙是引起肺纖維化的重要因素。機(jī)體吸入香煙煙霧之后將會改變其生理機(jī)制。Araya等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者的鱗狀氣道上皮細(xì)胞分泌的IL-1β可以促進(jìn)氣道成纖維細(xì)胞膠黏蛋白的表達(dá)，這主要是通過成纖維細(xì)胞αvβ8的過表達(dá)以及后續(xù)TGF-β的激活。因此，我們推測肺上皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和趨化因子可能會觸發(fā)TGF-β的激活。

TGF-β1是調(diào)節(jié)EMT的一種重要信號元素，了解TGF-β1在EMT中的具體信號機(jī)制將有助于減輕纖維化，同時保留TGF-β1在體內(nèi)重要的平衡功能[10]。Shp2有多種調(diào)節(jié)功能，如骨架重排、轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞增生[11]。Shp2 正向調(diào)控成纖維細(xì)胞的黏附和遷移，Shp2純合突變的成纖維細(xì)胞的伸展和遷移能力降低[12]。Shp2特異性抑制劑PHPS1可緩解吸煙引起的炎癥反應(yīng)，抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，其簡單的化學(xué)結(jié)構(gòu)及較好的藥效為臨床治療與Shp2相關(guān)疾病提供了新的手段[3]。近年來有文獻(xiàn)報道稱，阻斷Shp2能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT[13]。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)用CSE刺激肺泡上皮細(xì)胞可以激活Shp2, 促進(jìn)TGF-β1的表達(dá)。進(jìn)一步研究相關(guān)的機(jī)制，我們探索Shp2特異性抑制劑PHPS1是否能阻斷TGF-β1的上調(diào)，從而抑制CSE誘導(dǎo)的EMT。本研究結(jié)果顯示，PHPS1能抑制TGF-β1的上調(diào)，并且反轉(zhuǎn)CSE刺激后EMT相關(guān)因子的變化。我們推測Shp2可能是眾多EMT刺激劑的下游信號靶點。

正如以往報道的，EMT的形成依賴Smad信號途徑的激活[14]。且已有研究證明，抑制Smad2的活性或表達(dá)可以明顯抑制CSE誘導(dǎo)的EMT相關(guān)因子的表達(dá)變化[15]。本研究結(jié)果顯示，用CSE刺激肺泡上皮細(xì)胞能激活Smad2信號通路。值得注意的是，抑制Shp2的活性或表達(dá)可抑制Smad2的激活。本研究發(fā)現(xiàn)，CSE誘導(dǎo)的EMT可能經(jīng)過TGF-β1/Shp2/Smad2信號途徑，為深入研究肺纖維化的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。本研究初步探討了Shp2對香煙誘導(dǎo)的EMT的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果提示Shp2可能是治療COPD和肺癌的一個新靶點。

(致謝：感謝國家食品藥品監(jiān)督管理局浙江呼吸藥物研究實驗室提供的實驗條件和技術(shù)支持。)

[1] Sohal S S. Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and lung cancer: epithelial mesenchymal transition (EMT), the missing link[J]?EBioMedicine, 2015,2(11): 1578-9.

[2] 陳 晨，劉兆國，汪思亮，等. 薄荷醇及其受體TRPM8與腫瘤關(guān)系研究進(jìn)展[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2015,31(3): 312-4.

[2] Chen C，Liu Z G，Wang S L，et al. Research progress in the role of menthol and its receptor TRPM8 in tumor[J].ChinPharmacolBull，2015,31(3): 312-4.

[3] Li F F, Shen J, Shen H J, et al. Shp2 plays an important role in acute cigarette smoke-mediated lung inflammation[J].JImmunol, 2012,189(6): 3159-67.

[4] Guan Y, Li F F, Hong L, et al. Protective effects of liquiritin apioside on cigarette smoke-induced lung epithelial cell injury[J].FundamClinPharmacol, 2012,26(4): 473-83.

[5] Nabinger S C, Chan R J. Shp2 function in hematopoietic stem cell biology and leukemogenesis[J].CurrOpinHematol, 2012,19(4): 273-9.

[6] Wynn T A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis[J].JPathol, 2008,214(2): 199-210.

[7] Baginski T K, Dabbagh K, Satjawatcharaphong C, et al. Cigarette smoke synergistically enhances respiratory mucin induction by proinflammatory stimuli[J].AmJRespirCellMolBiol, 2006,35(2):165-74.

[8] Katzenstein A L, Mukhopadhyay S, Zanardi C, et al. Clinically occult interstitial fibrosis in smokers: classification and significance of a surprisingly common finding in lobectomy specimens[J].HumPathol, 2010,41(3): 316-25.

[9] Araya J, Cambier S, Markovics J A, et al. Squamous metaplasia amplifies pathologic epithelial-mesenchymal interactions in COPD patients[J].JClinInvest, 2007,117(11): 3551-62.

[10] Lopez-Novoa J M, Nieto M A. Inflammation and EMT: an alliance towards organ fibrosis and cancer progression[J].EMBOMolMed, 2009,1(6-7): 303-14.

[11] 何玲娟, 程洪強(qiáng), 柯越海, 等. 蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2在肺癌中作用的研究進(jìn)展[J]. 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志, 2016,30(1): 82-6.

[11] He L J, Cheng H Q, Ke Y H, et al. Roles of protein tyrosine phosphatase SHP2 in lung cancer[J].ChinJPharmacolToxicol, 2016,30(1): 82-6.

[12] Grossmann K S, Rosario M, Birchmeier C. The tyrosine phosphatase Shp2 in development and cancer[J].AdvCancerRes, 2010,106(4): 53-89.

[13] Li S, Wang L, Zhao Q, et al. SHP2 positively regulates TGFbeta1-induced epithelial-mesenchymal transition modulated by its novel interacting protein Hook1[J].JBiolChem, 2014,289(49):34152-60.

[14] Nawshad A, LaGamba D, Hay E D, et al. Transforming growth factor beta (TGFbeta) signalling in palatal growth, apoptosis and epithelial mesenchymal transformation (EMT) [J].ArchOralBiol, 2004,49(9): 675-89.

[15] Shen H J, Sun Y H, Zhang S J, et al. Cigarette smoke-induced alveolar epithelial-mesenchymal transition is mediated by Rac1 activation[J].BiochimBiophysActa, 2014,1840(6):1838-49.