沙門菌屬特異性檢測靶點堿基差異位點的識別及其血清型決定力

石秀清，周秀娟，施春雷，張 芬，史賢明*

沙門菌屬特異性檢測靶點堿基差異位點的識別及其血清型決定力

石秀清，周秀娟，施春雷，張 芬，史賢明*

（上海交通大學農業與生物學院，中美食品安全聯合研究中心，微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240）

以美國國家生物技術信息中心（NCBI）已公布的28 株沙門菌（14 個血清型）全基因組序列為研究對象，對前期研究獲得的7 個沙門菌屬特異性檢測靶點在不同血清型間的單核苷酸多態性進行比較分析，結果表明，S9和S69為堿基差異位點最多的兩個靶點，具有沙門菌分子血清分型的潛在能力。隨后，通過分析S9和S69在沙門菌不同血清型菌株中的差異位點，分別繪制兩個血清分型靶點的差異位點表，從而獲得了這兩個靶點同時用于14 個沙門菌血清型的快速分子血清分型的差異位點組合。在這些組合中，同一血清型具有相同的差異位點，不同血清型可以通過差異位點得以區分。最后，采集食品樣品192 份，用國標方法獲得疑似沙門菌21 株；利用血清分子分型靶點S9和S69進行快速分型，并同時用傳統玻片凝集反應鑒定方法進行驗證，兩種方法鑒定結果的符合率為100%。鑒定結果為：21 株沙門菌共包括4 個不同血清型，其中腸炎沙門菌10株、鼠傷寒沙門菌7 株、雞沙門菌2 株、紐波特沙門菌2 株?；蚪M序列分析結果和分離株分型結果均表明，沙門菌特異分子檢測靶點S9和S69相結合具備沙門菌的分子血清分型能力，以差異位點表為基礎建立的血清分型方法有望替代傳統的玻片凝集血清分型這一繁雜步驟，從而降低沙門菌血清鑒定的時間與成本，為聚合酶鏈式反應技術應用于沙門菌分子血清分型提供新思路。

沙門菌；分子血清分型；特異性檢測靶點；食品樣品；血清鑒定

沙門菌是引發食物中毒最主要的食源性致病菌之一，由其引發的食物中毒病例在世界范圍內居首位，每年全球約有1 600萬沙門菌感染病例出現，其中60萬 例死亡[1-2]。近年來，我國細菌性食物中毒暴發事件中，由沙門菌引起的約占70%～80%[3]。據統計，我國每年約有40 000 例沙門菌感染病例，但實際的感染人數可能要達20 倍以上[1]，食物傳播是導致人類感染沙門菌的最主要途經。沙門菌屬的菌株型別繁多，抗原復雜[4]，目前全世界已分離出沙門菌的血清型多達2 600 種，46 個血清組，而我國約有300 種血清型，37 個血清組[5]，這使得沙門菌溯源與污染特征的研究更加復雜。值得注意的是，沙門菌血清型存在明顯的宿主特異性[6]，特定的血清型常與食品類型相關聯[7-9]。因此，建立快速、靈敏的分子血清分型技術對食品污染源的追蹤、溯源，暴發疫情的鑒定以及最終有效地控制疫情意義重大。

當前世界各國家標準和ISO標準均采用傳統的細菌學方法從食品中分離檢測沙門菌[10]，并根據抗原-抗體反應免疫學原理（血清玻片凝集）鑒定其血清型。但此方法對于血清型的判讀流程繁瑣，操作人員的主觀判斷所占比例較大，誤差較大，重復性較差[11-12]。為了克服傳統血清玻片凝集分型技術的缺點，許多現代的分子生物學方法被應用于開發新型的分子血清分型技術中[13-17]，如：脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）、多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）和CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）等。而且隨著測序技術的不斷革新與進步，越來越多的沙門菌基因組序列已經測定完成并收錄在GenBank、Sanger等數據庫中[18]。它們與聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術相結合極大地促進了沙門菌的快速檢測與分子血清分型方法的發展[19-24]。

到目前為止，還沒有PCR技術同時用于沙門菌屬的檢測和血清分型的實例。2016年，Zhou Xiujuan等[25]基于美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）公布的26 株沙門菌和2 180 株非沙門菌的全基因組序列，采用比較基因組的方法，從生物信息學和生物再驗證兩個角度，最終獲得15 個性能優異的沙門菌屬特異性檢測靶點。在對這些檢測靶點進一步分析中，Zhou Xiujuan等[25]還發現其中7 個沙門菌檢測靶點與MLST中看家基因具有相似的保守性和血清型差異性，推測這些特異檢測靶點將在沙門菌的檢測和血清分型上具備巨大潛力。因此，這7 個沙門菌屬特異性檢測靶點不僅可以鑒定出未知菌株中的沙門菌，同時還具有進一步判定其血清型的潛力。

本實驗比較Zhou Xiujuan等[25]發現的7 個沙門菌屬特異性檢測靶點在不同血清型間存在的堿基差異位點，并評價這些差異位點對血清型的決定力。通過整理靶點在沙門菌不同血清型菌株中的差異位點，繪制出血清分型靶點的差異位點表，并將此表格應用于食品樣品中沙門菌的快速血清分型。最后將分子血清分型結果再與傳統玻片凝集反應實驗相比較，從而驗證靶點在實際應用中的血清分型效果。

1 材料與方法

1.1 菌株基因組序列

從NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上獲取并篩選得到2016年6月12日已公布的常見沙門菌菌株的全基因組，總共14 種血清型的28 株沙門菌菌株基因組，見表1。1.2 試劑與儀器

表1 用于血清分子分型靶點篩選的沙門菌基因組Table 1 Genome sequences of Salmonella strains used as molecular targets for serotyping

Taq DNA聚合酶、10×PCR buffer、Mg2＋（MBI Fermentas）、dNTPs、DNA Marker 北京天根生化科技有限公司。

PCR擴增儀、5415D臺式微量離心機 德國Eppendorf公司；PS2A200核酸電泳儀 美國Hoefer公司；GIS2020凝膠成像儀 上海天能公司；NanoDrop 2000c超微量分光光度計 美國Thermo Forma公司；EQR/GL-41超凈工作臺 新加坡Esco公司；血清鑒定試劑盒（20160101）寧波天潤生物藥業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 食品樣品采集

分別從上海市閔行區東川路A超市，春申路B超市，滄源路C菜市場，滄源路D超市和吳涇E超市5 個地點采集食品樣品192 份，用于沙門菌菌株的分離。樣品類型分別為肉制品類（55 份）、果蔬類（45 份）、速凍食品類（45 份）、即食食品類（47 份）。

1.3.2 MEGA 6.0軟件與分子血清分型靶點SNP差異位點表的構建

從NCBI數據庫中下載已完成測序的沙門菌全基因組序列。將NCBI中下載的序列，以相同靶點為單位，按照不同血清型排列并合為一個*.txt文本。將*.txt文本轉化為fasta格式后，使用MEGA 6.0軟件打開，以S. Typhi CT18對應的靶點序列為參比序列（從5’到3’依次編號）進行對齊處理，查找不同血清型中對照參比序列的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）差異位點。將所有SNP差異位點按照血清型的順序歸入Excel表格中。

1.3.3 沙門菌疑似菌株分離

采用GB 4789.4—2010《食品微生物學檢驗 總則》[11]分離獲得沙門菌疑似菌株。具體步驟包括：1）每份樣品取25 g或25 mL，移入225 mL緩沖蛋白胨水液體培養基中，在37 ℃的搖床（150 r/min）上增菌培養10 h；2）取1 mL增菌液轉種與10 mL四硫磺酸鈉煌綠增菌內，于42 ℃培養18～24 h，同時另取1 mL增菌液轉種與10 mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內，于37 ℃培養18～24 h；3）分別用接種環取增菌液1環，劃線接種于一個亞硫酸鉍瓊脂平板（于37 ℃培養40～48 h）和一個沙門菌屬顯色培養基平板（于37 ℃培養18～24 h），觀察各個平板上生長的菌落，若菌落為黑色有金屬光澤，棕褐色或灰色，則初步判定為沙門菌。

1.3.4 DNA的提取

參見文獻[15]，使用CTAB法提取沙門菌基因組DNA，取1 μL提取好的基因組DNA溶液，用超微量分光光度計NanoDrop 2000c在波長260 nm和280 nm條件下測定其純度與濃度，剩余DNA原液置于-20 ℃保存[3]。

1.3.5 PCR反應體系與參數

1.3.5.1 PCR反應體系

本實驗中PCR反應體系參照體系如下：(NH4)2SO4緩沖液（10×）2.5 μL、MgCl2溶液（50 mmol/L）1.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）1.5 μL、上、下游引物（各10 μmol/L）（0.5＋0.5）μL；TaqDNA聚合酶（1 U/μL）1.0 μL、模板2.5 μL；無菌去離子水15 μL總體積25 μL[3,25]。

1.3.5.2 PCR反應參數

檢測S9所用PCR的擴增條件為：94 ℃預變性5 min；接著進行35 個循環，每個循環包括94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s；循環結束后72 ℃延伸10 min；降溫至12 ℃，反應結束[25]。

檢測S69所用PCR的擴增條件為：95 ℃預變性10 min；接著進行35 個循環，每個循環包括94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s；循環結束后72 ℃延伸10 min；降溫至12 ℃，反應結束[3]。

1.3.5.3 所用引物序列

本實驗S9對應的引物為：S9-F：5’-GAGGTCACGCACCATCACAAT-3’和S9-R：5’-ATACGGCACCACCGCATAG-3?[25]。

S69對應的引物為：S69-F：5’-CACAGGAGGAGCAGGATAA-3’和S69-R：5’-CCAGTACAGCAAGGGACAT-3’[3]。

引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PCR產物序列測定由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.3.6 凝膠電泳

本實驗凝膠電泳步驟中，取5 μL PCR產物，與1 μL 6×加樣緩沖液混勻，混合物加到含有稀釋10 000 倍的核酸染料的1.5%瓊脂糖凝膠點樣孔中，同時在第1個點樣孔中加入5 μL 100 bp DNA ladder Marker，接通電源，凝膠電泳電壓控制為160～170 V，時間20～30 min。

1.3.7 沙門菌血清玻片凝集

依據抗原-抗體凝集原理，同時參照血清鑒定試劑盒產品說明書，根據不同的抗體凝集反應區分或分類鑒定沙門菌的血清型[26-27]。其中：H抗血清直接滴于干凈的載玻片上，加入等體積的菌懸液混合，若凝集即為陽性，反之為陰性；而O抗血清需要與高溫處理（100 ℃加熱15 min）的菌懸液混合，短時間內凝集為陽性，否則為陰性。根據凝集結果，對照血清型的抗原式表[26]來判斷沙門菌的血清型。

2 結果與分析

2.1 沙門菌屬特異性檢測靶點中SNP的識別

通過靶點引物，從NCBI上獲取的14 個血清型的28 株腸道沙門菌菌株基因組上尋找到該靶點的堿基序列。通過各個靶點片段序列之間的比對發現：同一血清型菌株對應靶點序列完全一致，而不同血清型沙門菌株間存在堿基差異，因此，這些特異性檢測靶點具備區分沙門菌血清型的潛力。

通過各靶點在不同血清型代表性菌株上對應基因片段的比較，以S. Typhi CT18對應的靶點序列為參比序列（從5’到3’依次編號），找出各靶點對應血清型之間的SNP位點個數，結果如圖1所示。結果顯示，在7 對沙門菌特異性靶點中，靶點S9對應片段在各血清型之間存在的SNP位點個數最多，其次是S69。王中強等[28]研究表明，在基因分型方法建立時，如果選擇很少位點進行測定便增加了由于等位基因聯合作用而造成混淆的概率，選擇位點數量的增加可以提高分辨率，但是當選擇的位點達到一定的數目，便只會增加人力、物力的消耗，而不能夠獲取更多的信息。實驗結果表明：S9能區分14 個血清型中的11 個，S69能區分14 個血清型中的9 個。所以本實驗如果僅以S9或者S69單個靶點對沙門菌進行血清分型，能夠區分的血清型種類比較有限。但如果將二者組合起來，能夠完全區分14 種沙門菌血清型。所以最終在7 個沙門菌屬特異性靶點中篩選出2 個沙門菌血清分型的靶點：S9和S69，作為沙門菌分子血清分型候選靶點。

圖1 沙門菌屬特異性檢測靶點在不同血清型沙門菌株上對應的SNP位點個數Fig. 1 Analysis of the serotyping ability of different Salmonella-specific targets by the number of SNPs

2.2 S9和S69堿基差異位點表的構建

采用S9和S69引物，對14 個血清型代表菌株基因組進行擴增，獲取兩靶點的基因片段序列。以S. Typhi CT18對應的S9序列為參比序列（從5’到3’依次編號），分析S9對應的14 個片段之間的堿基差異，對各位點進行編號和堿基變化統計，如表2所示。結果表明，靶點S9對應的14 個血清型菌株基因片段中，Newport、Gallinarum和Dublin這3 個血清型菌株對應的基因片段之間不存在堿基間的差異，即靶點S9無法區分這3 個血清型菌株。但是選取靶點S69，按照相同方法，對這3 個血清型菌株對應靶點堿基序列進行分析。結果顯示，靶點S69對應此3 個血清型菌株基因片段存在明顯堿基差異（差異位點如表2所示），能夠將這3 個血清型菌株完全區分。最終得到如表2所示的靶點S9和S69對14 個沙門血清型堿基差異位點表。

表2 靶點對應不同血清型的差異位點Table 2 Distinct mutation sites of different serotypes of Salmonella strains

2.3 堿基差異位點表應用于沙門菌食品分離株的血清分型

采集192 份食品樣品，按照GB 4789.4—2010[11]分離鑒定出21 份陽性樣本，從每份陽性樣本中選取分離株1 株，總共得到21 株疑似沙門菌菌株。經靶點S9 PCR擴增并進行凝膠電泳，此21 株菌均產生相應的明亮條帶，如圖2所示。結果表明，此21 株可疑沙門菌菌株全部為沙門菌。將S9擴增的PCR產物進行測序，測序結果對照表2，鑒定出這21 株沙門菌菌株中的17 株菌株的血清型：其中腸炎沙門菌10 株，鼠傷寒沙門菌7 株。余下4 株經S9擴增得到的序列完全一致，相互之間沒有堿基差異，無法用靶點S9區分。然后，再使用S69對這4 株菌進行DNA的PCR擴增并測序，測序結果與表2進行比對，鑒定出其中2 株為雞沙門菌，2 株為紐波特沙門菌，結果如表3所示。

圖2 沙門菌特異性靶點S9 PCR擴增Fig. 2 PCR amplification of Salmonella specific targets S9

2.4 傳統血清鑒定方法對食品分離菌株血清型的驗證

通過沙門菌H抗血清和O抗血清，對S9和S69鑒定的沙門菌菌株的血清型，即2.3節中21 株疑似沙門菌菌株對應的血清型進行驗證。傳統血清鑒定過程中，血清型菌株與對應血清型的H抗血清和O抗血清均發生陽性的凝集反應，其中腸炎沙門菌（9,12:g,m:－）10 株，鼠傷寒沙門菌（4,5,12:i:1,2）7 株，雞沙門菌（9,12:-:-）2 株，紐波特沙門菌（6,8:e,h:1,2）2 株。驗證結果表明：用靶點S9和S69所確定的沙門菌血清型與傳統血清鑒定方法驗證的結果符合率達到100%。證明沙門菌特異性分子檢測靶點S9和S69能夠快速準確地判定沙門菌血清型。最終統計結果如表3所示。

表3 食品樣品分菌與血清分型結果Table 3 Iolation, identification and serotyping of Salmonella isolates from food samples

3 結論與討論

對沙門菌進行分子血清分型時，選擇分散于基因組內多個位點進行測定，大大增加了血清區分能力，而且能夠建立起密切相關菌株的進化途徑。但是當選擇的位點達到一定的數目，便只會增加人力、物力的消耗，而不能夠獲取更多的信息[28]。因此，本實驗從7 個沙門菌屬特異性靶點中篩選得到堿基差異位點最多的兩個靶點——S9和S69。然后通過比較和整理S9與S69在沙門菌不同血清型菌株中的差異位點，繪制了血清分型靶點的差異位點表，從而獲得這兩個靶點同時用于14 個沙門菌血清型的快速分子血清分型的差異位點組合，最后將此組合應用于食品樣品分離株的血清分型。血清分型結果與傳統血清玻片凝集方法得到的結果進行比較，相符率達到100%。

在對比優勢上，傳統方法對食品中分離的疑似沙門菌進行鑒定時，需要經過生物化學鑒定和血清學分型驗證[29-30]。生物化學鑒定程序繁瑣，且需要用到生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統[11]。傳統血清分型則更需要經過多重的反復驗證才能確定沙門菌血清型，其重復確認操作加重了鑒定工作量，增加了時間和成本。且檢測過程中，操作人員的主觀判斷所占比例較大，誤差較大，重復性也差[29]。而用分子靶點對疑似沙門菌進行鑒定，只需要經過PCR擴增和凝膠電泳就可以判斷疑似菌株是否為沙門菌，然后將PCR產物測序，得到的序列與構建的靶點對應不同血清型差異位點組合進行比對，24 h內就能確定沙門菌的血清型。這一程序相對簡單，工作量少，成本低廉，操作人員的主觀判斷所占比例很小，重復性好。且比對現有的分子分型方法，如PFGE、MLST和CRISPR等，本研究開發的方法也具備兩大優點：其一，由于選用獨特的沙門菌屬特異性檢測靶點，所以它不僅能判斷疑似菌株是否為沙門菌，還能同步判斷該沙門菌的血清型。涵括了疑似菌株的生化鑒定和血清分型兩個過程；其二，分型靶點個數少，在成本和時間上比其他分子分型方法更具時間和成本優勢。

基于本實驗的研究結果，S9和S69兩個靶點能夠解決一定范圍內沙門菌血清型的判別，將特異性靶點不僅用于沙門菌的檢測更同步用于其血清分型，開創了沙門菌檢測和分型同步的先例，且能夠從分子層面上為沙門菌血清分型提供新思路。其快速有效的方式，對于及時有效控制沙門菌流行病學疾病的傳播與暴發起到至關重要的決定性作用。

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Identification of Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) in Different Serotypes of Salmonella-Specific Targets and Their Potential for Molecular Serotyping

SHI Xiuqing, ZHOU Xiujuan, SHI Chunlei, ZHANG Fen, SHI Xianming*
(MOST-USDA Joint Research Center for Food Safety, State Key Laboratory of Microbial Metabolism,School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

The single nucleotide polymorphisms (SNPs) in different serotypes of 7 specific targets for Salmonella detection were analyzed based on the whole genome sequences of 28 Salmonella strains (14 serotypes) published on NCBI. The results showed that S9 and S69 had more SNPs than any other target, making them a potential tool for Salmonella serotyping.Subsequently, the distinct nucleotide mutation sites of the two candidate molecular serotyping targets in different serotypes of Salmonella were analyzed. As a result, various combinations of the mutation sites were obtained for rapid molecular serotyping of 14 Salmonella serotypes, and the results showed that identical mutation sites existed in the same serovar,while different mutation sites were found in diverse serovars. Finally, 21 suspected Salmonella isolates were obtained by the national standard method from 192 food samples collected from supermarkets and open-air markets in Shanghai. The results of molecular serotyping by targets S9 and S69 were 100% consistent with the results of the traditional slide agglutination test; the Salmonella isolates were assigned to 4 different serovars, 10 strains of Salmonella Enteritidis, 7 strains of Salmonella Typhimurium, 2 strains of Salmonella Gallinarum and 2 strains of Salmonella Newport. The results of genome sequence analysis and strain serotyping showed that the combination of Salmonella-specific targets S9 and S69 had the potential for molecular serotyping of Salmonella, which is expected to be a time-saving and cheaper alternative to the traditional slide agglutination test and can provide a new idea for the application of PCR technology in Salmonella molecular serotyping.

Salmonella; molecular serotyping; Salmonella-specific targets; food samples; serum identification

2016-12-20

政府間國際科技創新合作重點專項（2016YFE0106100）

石秀清（1991—），男，碩士研究生，研究方向為食品安全與微生物。E-mail：249597976@qq.com

*通信作者：史賢明（1961—），男，教授，博士，研究方向為食品安全與微生物。E-mail：xmshi@sjtu.edu.cn

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724008

Q781

A

1002-6630（2017）24-0047-06

石秀清, 周秀娟, 施春雷, 等. 沙門菌屬特異性檢測靶點堿基差異位點的識別及其血清型決定力[J]. 食品科學, 2017,38(24): 47-52.

10.7506/spkx1002-6630-201724008. http://www.spkx.net.cn

SHI Xiuqing, ZHOU Xiujuan, SHI Chunlei, et al. Identification of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in different serotypes of Salmonella-specific targets and their potential for molecular serotyping[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 47-52.(in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724008. http∶//www.spkx.net.cn