單純皰疹病毒II型感染對生殖道上皮細胞間緊密連接和單核細胞趨化性影響的初步研究

呂曉文 鄧琳 楚鷹 黃先玫

論著

單純皰疹病毒II型感染對生殖道上皮細胞間緊密連接和單核細胞趨化性影響的初步研究

呂曉文 鄧琳 楚鷹 黃先玫

目的 探討人類單純皰疹病毒II型（HSV-2）感染對生殖道上皮細胞間緊密連接的影響及對單核細胞的趨化作用。方法 通過以人子宮內(nèi)膜腺癌細胞（HEC-1-A）小室培養(yǎng)模型為基礎(chǔ)建立生殖道體外單層細胞致密層模型，低劑量HSV-2感染后（MOI=0.1），檢測體外細胞活力；通過檢測跨膜電阻判斷細胞間緊密連接程度的變化；采用Western blot、熒光定量PCR法觀察細胞緊密連接蛋白ZO-1、E-cadherin和Occuldin的表達情況；通過單核細胞趨化反應(yīng)實驗來檢測感染HSV-2的HEC-1-A細胞培養(yǎng)上清液的趨化效應(yīng)。結(jié)果 與陰性對照組（Mock組）相比，HSV-2（MOI=0.1）感染使HEC-1-A單層細胞致密層跨膜電阻逐漸降低，且在感染中后期下降明顯（P＜0.01），而細胞活力無顯著變化（均＞80%）；隨著HSV-2病毒感染，ZO-1蛋白表達水平逐漸降低，在感染60h，該蛋白表達水平最低，而其mRNA表達水平無顯著變化（P＞0.05），E-cadherin和Occuldin均無顯著變化（均P＞0.05）；HSV-2感染HEC-1-A后的細胞上清液可誘導(dǎo)單核細胞產(chǎn)生明顯的趨化反應(yīng)（P＜0.01）。結(jié)論 低劑量HSV-2持續(xù)感染可降低HEC-1-A單層細胞致密層跨膜電阻，破壞細胞間緊密連接，很可能與下調(diào)ZO-1表達水平相關(guān)；感染后的細胞上清液可產(chǎn)生某種特殊的趨化分子介導(dǎo)免疫細胞向感染區(qū)域遷移浸潤。

單純皰疹病毒II型 緊密連接 趨化反應(yīng)

單純皰疹病毒（HSV）屬于皰疹病毒科的α-皰疹病毒亞科。在人類感染中，主要有單純皰疹病毒Ⅰ型（HSV-1）和Ⅱ型（HSV-2）兩類，也稱人類單純皰疹病毒Ⅰ型（HHV-1）和Ⅱ型（HHV-2）[1]。HSV 是導(dǎo)致面部器官及生殖道皰疹的重要病原體之一，能引起人類多種疾病，如齦口炎、角膜結(jié)膜炎、腦炎以及生殖系統(tǒng)感染和新生兒的感染。在感染宿主后，常在神經(jīng)細胞中建立潛伏感染，會反復(fù)激活循環(huán)。

HSV-2是目前傳播最廣的人類生殖器感染病原微生物之一，現(xiàn)代流行病學(xué)研究表明，HSV-2與人類免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）存在協(xié)同感染，HSV-2的生殖道感染可以增加HIV-1的感染率近2倍，并可能提高HIV-1在人群中的傳播率[2-3]。一直以來，人們認為HSV-2的感染會引起生殖道上皮層的創(chuàng)傷性病變，從而可能導(dǎo)致HIV-1的易感性，但兩者的共感染細胞分子機制并沒有得到具體明確的闡述。細胞緊密連接是細胞膜共同構(gòu)成一個事實上液體無法穿透的屏障，是兩個細胞間緊密相連的區(qū)域，而人生殖道上皮存在這樣的細胞間的緊密連接，其作用可能是用以抵御外部病原微生物的直接侵入和感染[4]。現(xiàn)有的研究證明，某些病毒可以改變上皮細胞的緊密連接程度，從而使病毒穿過上皮致密細胞層變得容易，如HIV-1和西尼羅河病毒等[5-6]。較多文獻報道，細胞緊密連接蛋白的表達與細胞間的緊密連接程度以及跨膜電阻具有重要的關(guān)系。本文旨在以人子宮內(nèi)膜腺癌細胞（HEC-1-A）小室培養(yǎng)模型為基礎(chǔ)建立體外生殖道單層細胞致密層模型，用以評估低劑量HSV-2感染對于生殖道上皮細胞緊密連接的影響；分析HSV-2感染對于HEC-1-A 3種主要的緊密連接蛋白ZO-1、E-cadherin和Occuldin表達的影響，HSV-2感染上皮細胞環(huán)境是否有利于免疫細胞的趨化反應(yīng)，為其他性傳播病原體建立感染提供基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗試劑：dibutyryl cAMP（美國Sigma-Aldrich公司），鼠抗人 ZO-1/E-cadherin/Occludin，SYBR Green Master Mix，Trizol reagent和胎牛血清（美國Life Technologies公司），鼠抗人GAPDH和RIPA裂解液（美國Santa Cruz公司），IRDye 800 goat-anti-mouse IgG（美國 LI-COR 公司），ReverTra Ace qPCR RT Kit（日本TOYOBO公司），DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基（美國 Hyclone公司），McCoy’s 5A培養(yǎng)基（加拿大Wisent公司），BCA蛋白定量試劑盒（美國Pierce公司），0.45μm 的低熒光 PVDF 膜、Millicell（24孔板，8μm，美國 Millipore公司），Transwell（24孔板，8μm，美國Corning公司），CCK-8反應(yīng)液（日本同仁化學(xué)）。其他試劑均為國產(chǎn)分析純級。病毒和細胞：人胚腎細胞HEK-293T、HEC-1-A、人單核細胞系U937和非洲綠猴腎細胞Vero來源于中國科學(xué)院細胞庫。HEC-1-A細胞培養(yǎng)于含有 10%FBS的 McCoy’s 5A培養(yǎng)基中，而HEK-293T和Vero細胞培養(yǎng)于含有10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，U937細胞培養(yǎng)于含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中。HSV-2（G）株在HEK-293T細胞上進行擴增[7]。細胞接種于10cm培養(yǎng)皿中，待細胞達到100%融合，分別接種病毒，接種量為MOI=0.1～0.2。培養(yǎng)48h，收集細胞上清液和細胞于50ml離心管中，于-80℃、-37℃反復(fù)凍融3次。離心去除細胞碎片，留取上清液，分裝并保存于-80℃。病毒滴定實驗在Vero細胞上進行檢測，將細胞按照1.5×104細胞/孔的密度接種于96孔板中，待細胞匯合后，將按照10×梯度連續(xù)稀釋的病毒液加入到對應(yīng)的孔中。培養(yǎng)48h后在倒置顯微鏡下計數(shù)嗜斑數(shù)量，從而確定病毒滴度。

1.2 方法

1.2.1 生殖道體外單層細胞致密層模型的建立及跨膜電阻、電阻率檢測 生殖道體外單層細胞致密層模型建立方法參考Moore等[8]的方法。HEC-1-A細胞可以形成單層細胞致密層，作為生殖道黏膜上皮細胞層模型[10-11]。HEC-1-A 細胞以 5×105cell/well密度接種 200μl至 Millicell培養(yǎng)上室中，在Millicell的下室加入900μl細胞培養(yǎng)基，確保內(nèi)外小室液面相同。在細胞接種24h后更換培養(yǎng)液1次，而后每隔2d換液1次培養(yǎng)液；在培養(yǎng)1周后，每隔1d更換培養(yǎng)基1次，持續(xù)培養(yǎng)3周。3周（21d）后，利用Millipore細胞電阻儀MERS00002對小室內(nèi)外的細胞跨膜電阻進行檢測，HEC-1-A單層細胞致密層跨膜電阻應(yīng)高于200Ω·cm2，電阻穩(wěn)定后可進行后續(xù)處理。設(shè)Blank組：空白培養(yǎng)基組；將細胞分為4組，即Mock組：不作任何處理；HSV-2組：細胞感染HSV-2（MOI=0.1）；HSV-2& 阿昔洛韋（Acyclovir）組：細胞感染 HSV-2（MOI=0.1）并 用 Acyclovir（10μg/ml）處 理 ；HSV-2&硫酸葡聚糖（Dx）組：細胞感染HSV-2（MOI=0.1）并用 Dx(100μg/ml)處理。分別在處理后 0、2、4、8、12、24、36、48、60h 檢測上述各組電阻，以 Blank 組為基礎(chǔ)背景電阻，各組電阻值均需減去Blank組電阻值后計算。電阻率=（HSV-2組細胞跨膜電阻-Blank組電阻）/（Mock組細胞跨膜電阻-Blank組電阻）×100%。

1.2.2 體外細胞活力檢測 采用CCK-8法，按照說明書進行操作。細胞以2×104/孔的密度接種于96孔板中，設(shè)Blank組：空白培養(yǎng)基；待細胞融合以后，將細胞分為兩組，每組9孔，一組不進行任何處理，另一組感染HSV-2（MOI=0.1）。分別在感染后 0、2、4、8、12、24、36、48、60h檢測各組細胞活性。檢測時將待檢測孔保留100μl的培養(yǎng)基，加入 CCK-8 工作液 10μl，于 37℃，5%CO2環(huán)境中撫育3h。之后采用瑞士TECAN公司的M200型全波段酶標儀檢測其在450nm的吸光度值并計算。細胞活力=（感染組細胞吸光度-Blank組吸光度）/（未感染組細胞吸光度-Blank組吸光度）×100%。

1.2.3 細胞間緊密連接蛋白表達水平的檢測 采用Western blot法。利用細胞刮刀收集細胞于1.5ml離心管中，用適量體積的RIPA裂解液冰上裂解30min。而后4℃，12 000g離心10min，收集上清液。利用BCA法測定上清液中的總蛋白濃度，而后調(diào)整蛋白總量。利用SDSPAGE分離蛋白，之后將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF上。將膜浸潤于Odyssey Blocking Buffer，封閉1h。將膜在一抗中撫育，室溫2 h或者4℃過夜。用PBS-T將膜洗滌5次，每次5min。將膜與熒光二抗稀釋液撫育，室溫1h，而后洗滌5次，每次5min。最后利用美國LI-COR Odyssey遠紅外掃描儀進行條帶的掃描和分析。

1.2.4 細胞間緊密連接蛋白mRNA表達水平的檢測采用熒光定量PCR法。細胞總RNA的提取利用Trizol試劑，方法參照產(chǎn)品說明書。提取的總RNA利用TECAN酶標儀進行定量，然后利用ReverTra Ace qPCR RT Kit進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第1鏈。熒光定量PCR使用SYBR Green法在實時熒光定量PCR儀（ABI Prism 7300）上進行，設(shè)置3個復(fù)孔。反應(yīng)體系和實驗中所使用的引物序列見表1。mRNA的表達水平采用ΔCt法計算，利用看家基因GAPDH進行標準化。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.2.5 單核細胞趨化反應(yīng)實驗 單核細胞趨化反應(yīng)實驗參考Sheth等[9]的方法。利用雙丁酰環(huán)磷腺苷（dibutyryl cAMP）誘導(dǎo)人組織細胞淋巴瘤細胞（U937）表達寡肽趨化受體，建立單核細胞趨化模型。首先調(diào)整U937細胞濃度至 3×105cells/ml，利用 dibutyryl cAMP（1mM）進行刺激72h，目的是將U937誘導(dǎo)為高表達寡肽趨化受體的單核細胞。待誘導(dǎo)完成后，離心收集細胞，利用含有0.5%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基進行重懸，將經(jīng)過誘導(dǎo)后的U937細胞放入Transwell（24孔板，孔徑8μm）的上室中，細胞密度控制在1×106cells/ml。在相應(yīng)下室中加入600μl待測培養(yǎng)液或陽性對照；將細胞分為6組，即Blank組：空白培養(yǎng)基；Mock SN：HEC-1-A細胞培養(yǎng)上清液；Mock SN（HT）：加熱處理的HEC-1-A細胞培養(yǎng)上清液；Infected HEC-1A SN：HSV-2（MOI=0.1）感染的HEC-1-A細胞培養(yǎng)上清液；Infected HEC-1-A SN（HT）：加熱處理的 HSV-2（MOI=0.1）感染的 HEC-1-A細胞培養(yǎng)上清液；fMLP：趨化反應(yīng)陽性對照，濃度為10nM。在上室加入經(jīng)dibutyryl cAMP誘導(dǎo)的U937細胞懸液200μl。Transwell平板置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h后，收集下室培養(yǎng)液對趨化細胞進行計數(shù)，判斷樣本的趨化效應(yīng)。1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSV-2感染對HEC-1-A單層細胞致密層跨膜電阻的影響 見圖1。

圖1 HSV-2感染對HEC-1-A單層細胞致密層跨膜電阻的影響（與 Mock 組相比，*P＜0.05，**P＜0.01）

由圖1可見，與Mock組比較，隨著HSV-2（G）病毒（MOI=0.1）對小室內(nèi)的單層細胞致密層感染時間的延長，所檢測到的跨膜電阻逐漸降低，并在36h后的各時間點差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；HSV-2&Dx組及HSV-2&Acyclovir組與Mock組相比，跨膜電阻未見明顯下降，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.2 HSV-2感染對HEC-1-A細胞活力及電阻率的影響 見圖2。

由圖 2可見，隨著 HSV-2（G）病毒（MOI=0.1）感染時間的延長，HEC-1-A細胞活力均＞80%；而HEC-1-A單層細胞致密層跨膜電阻逐漸下降，感染36h后下降明顯，感染60h時電阻率僅為30%。

2.3 HSV-2病毒感染對ZO-1、E-cadherin和Occuldin表達的影響 見圖3。

圖2 HSV-2病毒感染對HEC-1-A細胞活力及電阻率的影響

圖3 HSV-2感染對HEC-1-A 3種細胞間緊密連接蛋白表達的影響（a：Western blot法檢測蛋白表達水平；b：熒光定量PCR法檢測mRNA表達水平）

由圖3可見，隨著HSV-2病毒感染時間的延長，ZO-1的蛋白表達水平逐漸下降，尤其在感染60h，ZO-1的蛋白表達水平最低，而E-cadherin和Occuldin的蛋白表達水平無此降低趨勢；熒光定量PCR結(jié)果顯示，與Mock組相比，HSV-2感染后上述蛋白的mRNA表達水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.4 HSV-2感染對單核細胞趨化反應(yīng)的影響 見圖4。

圖4 HSV-2感染對單核細胞趨化反應(yīng)的影響（與Mock SN相比，**P＜0.01）

由圖4可見，Infected HEC-1-A SN中細胞數(shù)目明顯多于 Mock SN，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；Infected HEC-1-A SN（HT）中細胞數(shù)目雖略低于Infected HEC-1-A SN，但仍較高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

HSV-2是一種重要的生殖器皰疹病原體，全球HSV-2感染率較高，感染患者將終身攜帶這種病毒并周期性地出現(xiàn)生殖器皰疹性損傷；臨床數(shù)據(jù)分析顯示，HSV-2與HIV-1可以形成共感染，且HSV-2的感染可以促進AIDS的發(fā)生和進展[2-3]。然而，對于HSV-2如何促進HIV-1的感染，目前尚無一個較為定性和系統(tǒng)的研究。

本研究在體外建立了HEC-1-A單層細胞致密層模型，并利用低劑量的HSV-2病毒進行感染，結(jié)果顯示，病毒的持續(xù)性感染可以降低單層細胞致密層跨膜電阻，尤其在感染的中后期這種下降趨勢愈加明顯，從而可影響細胞的緊密連接程度，而體外細胞活力檢測感染后的HEC-1-A細胞活力均＞80%，也說明細胞的緊密連接程度的降低并非由直接的細胞凋亡和損傷所致。進一步研究發(fā)現(xiàn)，HSV-2感染可以誘導(dǎo)ZO-1蛋白表達水平下調(diào)，而對其mRNA水平無顯著性影響；另外兩種細胞緊密連接蛋白E-cadherin和Occuldin均無顯著變化；說明細胞緊密連接程度的下降很可能由ZO-1蛋白水平的降低引起。有報道顯示，HSV病毒的ICP0可以參與調(diào)控細胞泛素-蛋白酶體通路[12-14]，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system,UPS）是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要系統(tǒng)，是該通路的重要部分，在許多細胞功能中發(fā)揮關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用，其中包括抗原遞呈、細胞周期調(diào)節(jié)、細胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及DNA修復(fù)等；筆者推測HSV-2感染會介導(dǎo)ZO-1等細胞緊密連接蛋白通過泛素標記進入降解程序，為子代病毒或其他微生物的進入和感染提供便利條件。也就是說，HSV-2感染可能會改變天然生殖道表面致密細胞排列環(huán)境，并有利于其他病原微生物的侵入，如HIV-1。

HIV-1等其他病原微生物的生殖道持續(xù)性感染依賴于生殖道黏膜層免疫細胞的浸潤。研究表明，HSV-2感染可以招募大量免疫細胞浸潤生殖道淺上皮層；即使在治愈后，這些免疫細胞也會長期停留在上述部位[15]。這說明，HSV-2的感染會不可逆地改變生殖道上皮層的免疫細胞分布。本研究利用體外單核細胞趨化模型，發(fā)現(xiàn)HSV-2感染的HEC-1-A細胞上清液具有明顯的單核細胞趨化作用，甚至強于陽性對照fMLP；該上清液經(jīng)過熱處理后，仍然表現(xiàn)出很高的趨化作用，暗示HSV-2的感染會產(chǎn)生出一種熱穩(wěn)定性趨化因子，基本可以排除生物功能大分子（如細胞因子等）的作用。Bellner等[16]曾報道HSV-2的gG蛋白上aa190-205多肽對于單核細胞和中性粒細胞具有很強的趨化作用。HSV-2感染環(huán)境可以誘導(dǎo)趨化反應(yīng)的具體機制仍需進一步研究。本研究闡述了HSV-2感染會導(dǎo)致細胞緊密連接程度的下降以及使單核細胞發(fā)生趨化反應(yīng)，為HSV-2與其他性傳播疾病共感染提出了一種新的理論依據(jù)。

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Effect of HSV-2 infection on tight junction of genital epithelial cells and chemotaxis of monocytes

LYU Xiaowen,DENG Lin,CHU Ying,et al.Department of Pediatrics,Hangzhou First People's Hospital,Nanjing Medical University,Hangzhou 310006,China

Objective To investigate the effect of human herpes simplex virus type II(HSV-2)on intercellular tight junction of genital epithelial cells and the chemotaxis of monocytes. Methods The in vitro genital epithelial tight junction monolayer model based on HEC-1-A Millicell culture was developed.After infected with low dose HSV-2(MOI=0.1),the cell viability was tested and the transepithelial electrical resistance was measured at different time points to evaluate intercellular tight junction of HEC-1-A cells.The expression of ZO-1 protein was detected with Western blot and RT-PCR.The in vitro monocyte chemotaxis model was used through inducing U937 cell to express oligopeptide chemotaxis receptor,and monocyte chemotaxis was detected after HSV-2 infected HEC-1-A culture supernatant was added. Results The transepithelial electrical resistance of HEC-1-A cells was reduced by HSV-2 infection(MOI=0.1)gradually,especially in the middle and late period(P＜0.01),and the cell viability had no significant changes(above 80%).HSV-2 infection down-regulated the protein expression of ZO-1 in HEC-1-A cells,but had no effect on E-cadherin and Occuldin expression(P＞0.05).The supernatant from HSV-2 infected HEC-1-A cells culture strongly induced monocyte chemotaxis(P＜0.01). Conclusion Low dose HSV-2 infection can reduce transepithelial electrical resistance of HEC-1-A cells and damage cell tight junction,which may be related to down-regulation of ZO-1 protein;and also induce the chemotaxis of monocytes by release of chemotactic factors.

Herpes simplex virus type II(HSV-2) Tight junction Chemotaxis

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.22.2016-228

南京醫(yī)科大學(xué)科技發(fā)展基金面上項目（2015NJMU175）

310006 杭州市第一人民醫(yī)院/南京醫(yī)科大學(xué)附屬杭州醫(yī)院兒科（呂曉文、黃先玫），皮膚科（鄧琳）；江蘇大學(xué)附屬武進醫(yī)院中心實驗室（楚鷹）

黃先玫，E-mail：hxianmei630715@163.com

2016-12-16）

馬雯娜）