pEGFP-N1-MeCP2上調質粒的構建及意義

羅軍強

(荊門市第一人民醫(yī)院神經外科，湖北 荊門 448000；荊門市五三醫(yī)院外科，湖北 荊門 431821)

陳治軍，劉平非，馮雨，謝騰

(荊門市第一人民醫(yī)院神經外科，湖北 荊門 448000)

pEGFP-N1-MeCP2上調質粒的構建及意義

羅軍強

(荊門市第一人民醫(yī)院神經外科，湖北 荊門 448000；荊門市五三醫(yī)院外科，湖北 荊門 431821)

陳治軍，劉平非，馮雨，謝騰

(荊門市第一人民醫(yī)院神經外科，湖北 荊門 448000)

目的：構建MeCP2真核表達載體并在SH-SY5Y細胞中表達。方法：采用RT-PCR、pEGFP-N1-MeCP2質粒提取、Western blot檢測pEGFP-N1-MeCP2在在SH-SY5Y細胞中的表達。結果：將重組質粒pEGFP-N1-MeCP2與pEGFP-N1空載體組分別轉染至SH-SY5Y細胞中，48h后利用Western Blot檢測表明， 轉染pEGFP-N1-MeCP2的細胞在82 kDa處可見一特異性的表達帶，為MeCP2與GFP的融合蛋白，而在空載體組未見條帶；在27KDa附近，空載體組可見條帶，而轉染pEGFP-N1-MeCP2的細胞未見條帶，提示pEGFP-N1-MeCP2載體能夠在SH-SY5Y細胞中表達。結論：構建pEGFP-N1-MeCP2上調質粒是進一步研究MeCP2蛋白功能的基礎，也是研究MeCP2蛋白在帕金森病中作用機制的關鍵。

帕金森病；MeCP2；TH；SH-SY5Y細胞；6-OHDA

MeCP2在大多數組織中都有表達，但在大腦中表達最豐富。胞漿蛋白標準化的定量研究顯示，肺和脾也是MeCP2表達豐富的組織[1]。直接定量測定成年小鼠每個細胞核中MeCP2分子，大腦神經元有16000000個，膠質細胞中較少，而肝細胞中少30倍[2]。小鼠神經元中MeCP2水平出生時相對較低，出生后3個月快速增加，隨后達到平臺期[2,3]。由于出生時神經形成已經完成，神經元在一個恒定數目范圍內增加是由于MeCP2表達上調。而這個時候，這些神經元經歷著活躍的突觸發(fā)育。

鑒于MeCP2在大腦中可能作為大腦發(fā)育的調節(jié)因子或維持神經元/膠質功能的因子。我們的研究發(fā)現，MeCP2在帕金森病細胞模型中的表達下降，鑒于MeCP2在神經元中的作用，我們推測，MeCP2的表達下降可能參與了帕金森病的致病過程。因此，我們從人肺癌細胞cDNA文庫中獲得MeCP2基因，構建真核表達載體并在SH-SY5Y細胞中表達，為進一步研究MeCP2的功能打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y細胞株購自美國America Type Culture Collection(ATCC)細胞庫,人肺癌細胞A549，載體pEGFP-N1，感受態(tài)大腸桿菌DH 5α，D2000 plus DNA ladder、D2000 DNA ladder(Beijing Solarbio Science & Techology Co., LTD)，DNA聚合酶(TAKARA Bioiotechnology(Dalian) Co. ,LTD)，PstI(Fermentas Inc.)，XhoI(Fermentas Inc.)T4 DNA連接酶(Fermentas Inc.)，Trizol Reagent(Invitrogen Life Technologies)，TOYOBO First Strand cDNA Synthesis Kit ReverTra Ace -α(TOYOBO CO,LTD)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Tiangen Biotech(Beijing) CO.,LTD)，10mM dNTPs(Fermentas Inc.)。一抗：MeCP2大鼠抗人抗單克隆抗體購 自美國Sigma公司，TH羊抗人抗單克隆抗體購自購自 Santa Cruz公司；Westem blot檢測試劑盒購自上海晶美生物公司。二抗：兔抗鼠、鼠抗羊二抗均購自福州邁新生物技術開發(fā)公司。β-肌動蛋白(β-actin)抗體購自美國Santa Cruz 公司。

1.2 方法

1)pEGFP-N1-MeCP2質粒構建 據MeCP2基因的CDC區(qū)設計引物及酶切位點：設計包含Pst I 和 Xho I (Promega USA)酶切位點的擴增MeCP2全長引物。上游引物5’ GCGCTCGAGGGTAAAAGCCGTCCGGAAAAT3’和下游引物5’CGGCTGCAGGCTAACTCTCTCGGTCACGGGC3’。其中包含下劃線的為所含酶切位點。利用PCR擴增MeCP2編碼序列，反應體系為50μL：10×PCR緩沖液5μL，dNTP 5μL、Taq酶 2.5μL、cDNA模板2μL，上下游引物(10μmol)各1.5μL。PCR反應條件：94℃ 2min、94℃ 10s、55℃ 30s、68℃ 80s，共32個循環(huán)；68℃延伸3min。68→94℃、30s→64℃、30s→72℃，4min(30次)末段延伸72℃、10min。將獲得的PCR產物通過凝膠電泳明確擴增大小后，利用前述切膠回收方法純化PCR產物。取PCR產物利用XhoⅠ和KpnⅠ酶雙酶切，回收大片段，加T4連接酶16℃水浴過夜。連接產物轉化感受態(tài)DH5a，將轉化產物均勻涂布于含100mg/L氨芐青霉素的LB選擇平板上倒置培養(yǎng)過夜。篩選2～3個菌落，搖菌后取1μL進行PCR擴增鑒定；小量提取質粒DNA，進行雙酶切鑒定，將雙酶切鑒定正確的質粒送華大基因測序。

2)pEGFP-N1-MeCP2質粒真核細胞表達的western blot檢測鑒定 SH-SY5Y細胞轉染pEGFP-N1-MeCP2質粒，提取總蛋白western blot表達鑒定。操作過程：蛋白樣品提取；蛋白濃度測定；SDS-PAGE電泳；轉膜，封閉；結合一抗，置于4℃搖床過夜；結合二抗，將抗體稀釋液加入PVDF膜后置于搖床室溫震搖1h；洗膜4次，每次5min,后利用PBS洗膜三次去除殘存的Tween-20，利用ECL發(fā)光液暗室曝光顯色并分析蛋白表達強弱。

2 結果

2.1 PCR擴增MeCP2 cDNA片段

通過PCR擴增的方法成功獲得了MeCP2 cDNA片段，PCR的產物在l%瓊脂糖凝膠上的分析，特異性片段的大小為1531bp。見圖1。

2.2 重組質粒的鑒定結果

1)限制性內切酶酶切鑒定結果 用PstI和Xho I雙酶切重組質粒pEGFP-N1-MeCP2得到與預期大小相符的外源基因插入片段，結果與PCR產物的大小1531bp比對相吻合，說明克隆成功。見圖2。

圖1 MeCP2 PCR產物瓊脂糖電泳圖 圖2 pEGFP-N1-MeCP2 質粒酶切鑒定圖

2)測序鑒定結果 將重組質粒重組質粒pEGFP-N1-MeCP2送去進行測序，比對與MeCP2的序列一致，說明插入的片段是正確的，克隆成功。

2.3 pEGFP-N1-MeCP2的表達鑒定結果

將重組質粒pEGFP-N1-MeCP2與pEGFP-N1空載體組分別轉染至SH-SY5Y細胞中，48h后利用Western Blot檢測表明， 轉染pEGFP-N1-MeCP2的細胞在82 kDa處可見一特異性的表達帶，為MeCP2與GFP的融合蛋白，而在空載體組未見條帶；在27KDa附近，空載體組可見條帶，而轉染pEGFP-N1-MeCP2的細胞未見條帶，提示pEGFP-N1-MeCP2載體能夠在SH-SY5Y細胞中表達。見圖3。

圖3 重組質粒pEGFP-N1-MeCP2與pEGFP-N1空載體組分別轉染至SH-SY5Y細胞中的表達鑒定

3 討論

自從第一次發(fā)現MeCP2調節(jié)腦中特定區(qū)域基因的表達，包括正面的和負面的作用，以及獨立活性依賴的調節(jié)[4,5]。目前，研究越來越多的集中于MeCP2的目標基因。發(fā)生于神經科學上MeCP2基因的缺失和過表達，發(fā)現的第一個與MeCP2相關的基因是腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)。BDNF是一個生長因子，與神經元再生、神經元成熟、神經元功能維持及神經元存活、鈣離子穩(wěn)態(tài)、及突觸可塑性方面發(fā)揮著重要作用，以及在學習、記憶、神經功能障礙中發(fā)揮重要作用[6]。

目前，腦內MeCP2與BDNF的機制尚不清楚[7,8]，但是MeCP2表達的高低卻與BDNF緊密相關[9]。體外培養(yǎng)的小鼠皮質神經元中，過表達MeCP2提高了BDNF表達[10]，然而，因突變致MeCP2基因失去功能的小鼠，腦內BDNF表達降低[9]。MeCP2基因突變的小鼠，腦內BDNF恢復正常水平時，許多Rett綜合征類似的生理學和行為缺陷癥狀得到了改善[11,12]。在培養(yǎng)神經細胞試驗中發(fā)現，MeCP2與BDNF第三啟動子結合抑制BDNF轉錄[4,13]。MeCP2基因突變的小鼠與野生型相比，BDNF蛋白表達和基因表達均下降了70%[14]。BDNF表達下降被認為造成了Rett綜合征的病理過程。更重要的是，這些發(fā)現提示有些基因的活性受MeCP2調控。膜的去極化導致了MeCP2的磷酸化，引起目標基因啟動子的釋放，從而引起轉錄激活[4]。MeCP2基因敲除的小鼠，神經元活性受影響，研究MeCP2基因表達下降和其他基因表達提高之間的關系很困難。雖然MeCP2被廣泛的認為是一個轉錄抑制因子，最近的研究顯示，他可以與活性基因結合而調節(jié)基因表達[14～16]。

經證實，MeCP2可以抑制Dlx5、 Dlx6、Fxyd1、Reln和Gtl2的表達[17,18]。無MeCP2表達的小鼠，前額葉Dlx5、 Dlx6的轉錄作用明顯加強[17]。在無MeCP2基因表達的小鼠和Rett綜合征患者，前額葉Fxyd1表達明顯較高[19]。在無MeCP2基因表達的小鼠和Rett綜合征患者，BDNF、GABRB3和UBE3A的表達下降[20]。這些基因在調控神經發(fā)育階段的樹突結構和GABA能神經元功能方面發(fā)揮著重要作用。Dlx5和GABRB3是GABA能神經元發(fā)揮作用所必須的，前者調節(jié)合成GABA，后者則與GABA受體亞單位結合[20,21]。這些在額葉表達的基因與GABA能神經元的相互作用，證實了Rett綜合征患者額葉GABA能神經元信號通路的功能紊亂[22]。然而，涉及到樹突形態(tài)學改變的基因可以解釋Rett綜合征和無MeCP2基因表達小鼠樹突修飾的原因。

Skirmantas Kriaucionis(2006)研究發(fā)現[23]，無MeCP2表達的小鼠腦組織中Uqcrc1過表達，Uqcrc1可以顯著增加線粒體呼吸容量以及減少呼吸效率，過表達的Uqcrc1可導致N2A細胞(小鼠神經元細胞)線粒體呼吸功能的異常；他們通過電子顯微鏡(透射電鏡)觀察野生型和無MeCP2表達的小鼠腦組織沒有發(fā)現線粒體總體結構的異常。體內實驗顯示MeCP2與Uqcrc1的啟動子區(qū)結合，無MeCP2表達的小鼠，Uqcrc1表達提高以及導致神經學上的癥狀。在酶作用底物提供呼吸鏈復合體Ⅰ或呼吸鏈復合體Ⅱ，含有Uqcrc1蛋白的呼吸鏈復合體Ⅲ導致了異常的線粒體呼吸功能。Blue native electrophoresis 檢測顯示：MeCP2突變的小鼠，呼吸鏈復合體Ⅰ活性正常，提示呼吸鏈復合體Ⅰ沒有提高異常的線粒體呼吸功能；這些研究顯示，呼吸鏈復合體Ⅲ是增強線粒體呼吸功能的原因。在細胞系中，過表達的Uqcrc1與上游的呼吸鏈復合體Ⅳ酶作用底物促使線粒體呼吸速率提高。在Pavel(2009)的實驗中[24]，MeCP2基因突變的小鼠，超微結構顯示軸突和樹突異常，以及異常擴展的線粒體和脊膜。JC Russell(2007)[25]首次發(fā)現，首次發(fā)現，在低氧和興奮性毒性誘導干預的小腦顆粒神經元，MeCP2功能下降。完全MeCP2基因敲除小腦顆粒神經元較野生型死亡過程發(fā)生較早；在缺少MeCP2蛋白表達的CGC細胞與野生型的相比，神經元死亡明顯較多，其過程是缺少MeCP2蛋白引起線粒體功能紊亂，線粒體釋放caspase和AIF，從而啟動神經元的凋亡。鑒于MeCP2基因滅活抑制基因的表達及其所致的轉錄紊亂，過表達的死亡復合體在中樞神經系統(tǒng)活性增加，使得神經元更容易受損以致死亡。

綜上所述，MeCP2蛋白在神經元中有著很重要的生物學作用，并且與Rett綜合癥等相關疾病有著密切的聯(lián)系；我們已經證實，MeCP2可能參與了帕金森病的發(fā)病過程。為了進一步研究MeCP2蛋白在帕金森病中的作用機制，本研究克隆得到了MeCP2的全長編碼序列，并通過Western Blot檢測表達的融合蛋白在SH-SY5Y細胞中的表達，為進一步研究其功能打下基礎。

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2017-09-26

湖北省自然科學基金項目(2014CFB09)；湖北省荊門市科技計劃項目(2013S01)；湖北省荊門市科技計劃項目(2015S01)；荊門市重點科技計劃項目(YFZD2016045)。

羅軍強(1976-)，男，主治醫(yī)師，主要從事神經退行性疾病的診療工作；通信作者：謝騰，44255018@qq.com。

[引著格式]羅軍強，陳治軍，劉平非，等. pEGFP-N1-MeCP2上調質粒的構建及意義[J].長江大學學報(自科版), 2017,14(24):48～52.

R34

A

1673-1409(2017)24-0048-05

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