姜黃素對沙漠干熱環境下大鼠腸黏膜損傷及氧 化應激的影響

董 翔，劉江偉，王金泉，許永華，李佳佳，馬 娜

(1.新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830052； 2.新疆軍區總醫院新疆特殊環境醫學重點實驗室， 烏魯木齊 830002)

姜黃素對沙漠干熱環境下大鼠腸黏膜損傷及氧 化應激的影響

董 翔1,2，劉江偉2*，王金泉1*，許永華2，李佳佳2，馬 娜2

(1.新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830052； 2.新疆軍區總醫院新疆特殊環境醫學重點實驗室， 烏魯木齊 830002)

研究報告

目的探討姜黃素預處理對沙漠干熱環境下大鼠腸黏膜的保護作用。方法雄性SPF級大鼠80只，隨機分為生理鹽水對照組(NC組)40只、姜黃素預處理組(HDC組)40只。NC組生理鹽水灌胃，HDC組200 mg/kg姜黃素灌胃，連續7 d，每天1次。將各組大鼠置于模擬沙漠干熱環境的實驗艙中，溫度：(41±0.5)℃，相對濕度：(10±2)%。在0、50、100、150 min時間點，分別隨機取出NC組、HDC組大鼠(每組10只)，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，留取回腸樣本進行病理學觀察評分及氧化應激指標CAT、SOD、MDA的檢測。結果在0、50 min時間點，HDC組較NC組病理損傷評分無顯著性差異(P> 0.05)；在100、150 min時間點，HDC組病理損傷評分較NC組顯著降低(P< 0.01)。在50、100、150 min時間點，HDC組CAT、SOD活力較NC組顯著升高(P< 0.05或P< 0.01)，HDC組MDA含量較NC組顯著降低(P< 0.05或P< 0.01)。暴露于干熱環境中，NC組腸黏膜病理損傷評分與CAT、SOD活力呈負相關(r=-0.9128，r=-0.9125，均P< 0.01)，與MDA含量呈正相關(r=0.9258，P< 0.01)。結論姜黃素預處理對沙漠干熱環境下大鼠腸黏膜具有保護作用，其機制可能與姜黃素抑制腸黏膜氧化應激反應有關。

姜黃素；腸黏膜；氧化應激；沙漠干熱環境

中暑是由內源性的新陳代謝產熱及外源性的高溫環境，或兩者共同作用下引起的一種繼發于熱損傷之后的全身炎癥反應綜合征(SIRS)，并有可能引發多器官功能障礙(MODS)甚至死亡[1]。腸道作為人和脊椎動物最大的儲菌庫和屏障系統是熱打擊的首發器官，其損傷后造成的內毒素泄露，是誘導熱應激向中暑發生發展的始動因素[2]。沙漠干熱環境具有氣候干燥炎熱、體表水分蒸發量大、日照時間長、降雨量少、植被稀疏和紫外線強度高等特點，長時間處于這樣的環境中激增了中暑的發病風險[3]。本課題組前期研究表明姜黃素預處理能顯著提高大鼠在沙漠干熱環境中的生存時間[4]，因此我們推測姜黃素可能對大鼠腸黏膜具有保護作用，本研究進一步探討姜黃素對沙漠干熱環境下大鼠腸黏膜損傷及氧化應激的影響，為預防沙漠干熱環境下中暑和改善預后提供基礎理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠80只，體重210～230 g，購自新疆醫科大學實驗動物中心[SCXK(新)2016-0003]。實驗及相關操作在新疆軍區總醫院實驗動物科SPF級動物實驗室進行[SYXK(新)2016-0003]。動物實驗均獲新疆軍區總醫院倫理委員會批準，并遵照國家科學委員會要求予以關懷照顧。

1.2 主要試劑與儀器

姜黃素(日本化成株式會社)；BCA蛋白檢測試劑盒(美國Themo Scientific)；MDA、SOD、CAT檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

西北特殊環境人工實驗艙(新疆軍區總醫院研制)；光學顯微鏡CH20(Olympus)；酶標儀M550(日本Bio-Rad)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

所購大鼠在SPF級動物實驗室適應性飼養7 d，溫度：(21±2)℃，相對濕度：(45±5)%。將80只大鼠隨機分為2組(每組40只)：生理鹽水對照組(NC組)，生理鹽水灌胃；姜黃素預處理組(HDC組)，200 mg/kg姜黃素(溶解于0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液中)灌胃，每天1次，持續7 d，灌胃期間滅菌飼料和水自由攝取。灌胃結束后第1天提前12 h禁食，將各組大鼠置于西北特殊環境人工實驗艙中，實驗艙模擬沙漠干熱環境，溫度：(41±0.5)℃，相對濕度：(10±2)%，并禁食禁水。

1.3.2 樣本采集

在0、50、100、150 min時間點，分批次隨機取出NC組、HDC組大鼠(每組10只)。3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔深度麻醉后，距離回-盲腸交界約1 cm處迅速截取回腸組織學樣本2份，一份回腸樣本用液氮冰凍后儲存于-80°C冰箱，用于氧化應激指標的檢測，另一份回腸樣本置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于蘇木素-伊紅染色及光學顯微鏡下病理學觀察及評分。

1.3.3 病理學觀察及評分

回腸樣本固定24 h后，進行石蠟包埋、切片、H&E染色、中性樹脂封片。光學顯微鏡觀察大鼠回腸組織病理學變化。每張切片隨機選取10個視野，采用Chiu’ s[5]評分標準進行量化，平均10個視野的評分之和，記為每張切片的病理學損傷評分。

1.3.4 腸黏膜CAT、SOD、MDA的測定

從-80℃冰箱取出回腸樣本，稱量100 mg樣本置于玻璃勻漿器中，并加入200 μL預冷的PBS，充分勻漿后加入700 μL預冷的PBS。4℃離心機3500 r/min離心10 min，取上清液即為10%的回腸組織勻漿液。分裝后，嚴格按試劑盒產品說明書提供方法測定回腸組織勻漿液中CAT活力、SOD活力、MDA含量。

注：(A)0 min NC組；(B)50 min NC組；(C)100 min NC組；(D)150 min NC組；(E)0 min HDC組；(F)50 min HDC組；(G)100 min HDC組；(H)150 min HDC組。圖1 回腸病理學損傷變化(Bar=100 μm) (A)NC group, 0 min.(B)NC group, 50 min.C)NC group, 100 min. D)NC group, 150 min.(E)HDC group, 0 min.(F)HDC group, 50 min.(G)HDC group, 100 min.(H)HDC group, 150 min.Fig.1 Pathological changes of the rat ilea

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 腸黏膜病理學損傷變化

光學顯微鏡下觀察發現，在0 min時間點，NC組、HDC組腸黏膜上皮細胞完整，無病理學損傷(見圖1 A、E)。在50 min時間點，NC組、HDC組病理學變化以固有層頂部毛細血管擴張充血，偶見上皮細胞與固有層之間水腫、間隙增大為主(見圖1B、F)。在100 min時間點，NC組腸黏膜部分上皮細胞脫落，固有層裸露(見圖1C)；HDC組腸黏膜固有層邊緣輕度水腫、毛細血管擴張充血，頂部上皮細胞排列紊亂(見圖1G)。在150 min時間點，NC組腸黏膜上皮細胞片狀壞死脫落，固有層裸露、邊緣毛細血管擴張充血，固有層中大量嗜中性粒細胞侵潤(見圖1D)；HDC組腸黏膜頂部固有層邊緣毛細血管充血，上皮細胞嗜酸變，偶見頂部上皮細胞脫落(見圖1H)。

2.2 腸黏膜病理學損傷評分

如圖2所示，NC組、HDC組腸黏膜病理學損傷評分隨干熱暴露時間的延長呈上升趨勢。在0、50 min時間點，NC組較HDC組病理損傷評分差異無顯著性(P> 0.05)，在100、150 min時間點，HDC組病理損傷評分較NC組均降低(P< 0.01)。

注：與NC組比較，** P< 0.01。圖2 回腸病理學損傷評分Note.Compared with the NC group，** P< 0.01.Fig.2 Pathological injury scores of the rat ilea

2.3 腸黏膜CAT、SOD、MDA的變化

如圖3-A所示，NC組、HDC組回腸CAT活力隨干熱暴露時間的延長呈下降趨勢。在0 min時間點，組間CAT活力差異無顯著性(P> 0.05)；在50 min時間點，HDC組CAT活力較NC組升高(P< 0.05)；在100 min時間點，HDC組CAT活力較NC組升高(P< 0.01)；在150 min時間點，HDC組CAT活力較NC組升高(P< 0.01)。

注：與NC組比較，* P< 0.05，** P< 0.01。圖3 回腸氧化應激指標變化 Note.Compared with the the NC group，* P< 0.05，** P< 0.01.Fig.3 Changes of oxidative stress indexes in the rat ilea

如圖3-B所示，NC組、HDC組回腸SOD活力隨干熱暴露時間的延長呈下降趨勢。在0 min時間點，組間SOD活力差異無顯著性(P> 0.05)；在50、100、150 min時間點，HDC組SOD活力較NC組升高(P< 0.01)。

如圖3-C所示，NC組、HDC組回腸MDA含量隨干熱暴露時間的延長呈上升趨勢。在0 min時間點，組間MDA含量差異無顯著性(P> 0.05)；在50 min時間點，HDC組MDA含量較NC組降低(P< 0.05)；在100 min時間點，HDC組MDA含量較NC組降低(P< 0.01)；在150 min時間點，HDC組MDA含量較NC組降低(P< 0.01)。

2.4 病理學損傷評分與CAT、SOD、MDA的相關性分析

在沙漠干熱環境下NC組大鼠回腸病理損傷評分與氧化應激指標CAT、SOD、MDA的相關性分析中，病理學損傷評分與CAT活力呈顯著負相關(r=-0.9128，P< 0.01)；病理學損傷評分與SOD活力呈顯著負相關(r=-0.9125，P< 0.01)，病理學損傷評分與MDA含量呈顯著正相關(r=0.9258，P< 0.01)。

3 討論

中暑時心排血量增加，并通過分流胃腸道血液到皮膚和肌肉來最大限度的散發熱量[6]。腸黏膜血流量減少、灌注不足及熱應激時細胞的高代謝需求產生大量活性氧，將造成腸上皮細胞和基質的氧化應激損傷[7]。ROS產生于細胞的基本生理過程(例如：呼吸)，在正常的生理狀態下具有調節細胞增殖、生理機能和活性的功能[8]，并由超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、硫氧化還蛋白(TRX)、過氧化氫酶(CAT)、谷氧還蛋白(GRX)等抗氧化物酶作為自由基清除劑調節ROS的濃度水平[9]。線粒體處于ATP合成的中心是ROS產生的重要來源，也是對細胞內外環境應激最為敏感的細胞器之一[10]。有證據表明持續的高溫，可導致ATP合成減少，細胞內鈣離子穩態失衡，線粒體通透性改變，線粒體中產生過量的ROS，損害蛋白質、脂質和DNA，進一步降低線粒體能量合成效率并通過興奮性級聯反應產生更多的氧自由基，并最終導致細胞凋亡或壞死[11]。因此維持ROS產物與抗氧化防御系統之間的動態平衡是保證細胞正常功能必不可少的條件。本研究發現，隨著沙漠干熱環境下暴露時間的延長，大鼠腸黏膜病理損傷程度不斷加重，腸黏膜抗氧化物酶CAT、SOD活力呈下降趨勢，脂質過氧化產物MDA含量呈上升趨勢，腸黏膜病理損傷評分與CAT、SOD、MDA的活力或含量呈顯著相關性，提示暴露于沙漠干熱環境導致的氧化應激反應是造成大鼠腸黏膜損傷的重要原因之一。

姜黃多年生姜科屬植物，在中國和印度的傳統醫學中有幾百年的應用歷史，被廣泛的使用在多種疾病的治療[12]。姜黃素是從干燥姜黃的根莖中提取的一種天然的疏水性多酚類化合物，是其中主要的活性成分。有研究發現姜黃素的烯醇形式具有清除自由基的能力，使姜黃素具有抗氧化性[13]。另有研究認為姜黃素通過化學分子式中的酚羥基及β-二酮以提供質子的方式，調節細胞中多條信號傳導通路，發揮其抗氧化的作用[14]。Cucolas等[15]發現姜黃素可以上調小腸中TRAIL的含量，抑制COX-2、NF-κB的表達，減輕腸黏膜缺血再灌注造成的病理損傷和氧化應激。Kim等[16]研究發現姜黃素可通過調節氧化應激和核轉錄因子E2相關因子2(Nrf2)信號通路上調尿液中的SOD濃度，下調MDA濃度抑制腎臟的氧化應激反應，發揮保護腎臟的作用。Yang等[17]研究發現姜黃素通過抑制Notch信號通路，改善H2O2刺激內皮細胞造成的氧化應激損傷，降低ROS含量和細胞凋亡指數。Salh等[18]發現二硝基苯磺酸(DNB)誘導的小鼠結腸炎模型，可通過飼喂添加含有0.25%姜黃素的飼料，抑制NF-κB通路和p38絲裂原活化蛋白激酶活化，降低結腸iNOS表達和嗜中性粒細胞侵潤。但關于姜黃素對沙漠干熱環境下中暑大鼠腸黏膜氧化應激損傷的研究尚未見報道，本研究發現在50 min時間點，NC組、HDC組腸黏膜病理學損傷以固有層頂部毛細血管擴張充血，偶見上皮細胞與固有層之間水腫、間隙增大為主，NC組較HDC組病理損傷評分無顯著性差異，這可能與熱應激早期機體處于代償期，導致ROS誘發抗氧化能力增強有關。在100、150 min時間點，姜黃素預處理各組腸黏膜病理損傷程度降低，CAT、SOD活力增加，MDA含量降低，提示姜黃素預處理可能通過提高腸黏膜抗氧化物酶活力，抑制ROS過量產生導致的脂質過氧化反應，對腸黏膜具有一定的保護作用。

總之，暴露于沙漠干熱環境中大鼠腸黏膜損傷程度隨暴露時間的延長而不斷加重，而姜黃素預處理對沙漠干熱環境下大鼠腸黏膜具有保護作用，其機制可能與姜黃素抑制腸黏膜氧化應激反應有關。

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Protectiveeffectofcurcuminontheintestinalinjuryandoxidativestressinratsindryandhotdesertenvironment

DONG Xiang1,2, LIU Jiang-wei2*, WANG Jin-quan1*, XU Yong-hua2, LI Jia-jia2, MA Na2

(1.College of Veterinary Medicine, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China； 2.The Key Laboratory of Special Environmental Medicine of Xinjiang, General Hospital of Xinjiang Military Region, Urumqi 83000)

ObjectiveTo investigate the protective effect of curcumin pretreatment on the intestinal mucosa in rats in dry and hot desert environment.MethodsEighty male SPF grade rats were randomly divided into saline control group (NC group) and curcumin pretreatment group (HDC group) (40 in each group). Rats in the NC group were gavaged with saline, and rats in the HDC group were gavaged with curcumin (200 mg/kg), once a day for 7days. The rats were placed in a cabin simulating the dry and hot desert environment (41±0.5)℃ and relative humidity of (10±2)%. Rats were randomly taken from each groups (n=10) and sacrificed with 3% sodium pentobarbital intraperitoneally at 0 min, 50 min, 100 min and 150 min time points. The ileal tissue was stained for histological examination and oxidative stress index was detected.ResultsAt time points 0 min and 50 min, the pathological injury scores of the HDC group were not significantly different compared with the NC group (P> 0.05). At time points 100 min and 150 min, the pathological injury scores of the HDC group were significantly decreased compared with the NC group (P< 0.01). At time points 50 min, 100 min and 150 min, the CAT and SOD activity of HDC group were significantly increased compared with the NC group (P< 0.05 orP< 0.01). The MDA content of HDC group were significantly decreased compared with the NC group (P< 0.05 orP< 0.01). Exposed to dry and hot environment, the pathological injury scores of the NC group were negatively correlated with CAT and SOD activity (r=-0.9128,r=-0.9125,P< 0.01), and positively correlated with MDA content (r=0.9258,P< 0.01).ConclusionsCurcumin pretreatment can protect the intestinal mucosa of rats in dry-heat environment of desert, and curcumin can alleviate the pathological damages of intestinal mucosa by inhibiting the oxidative stress in intestinal mucosa.

Curcumin; Intestinal mucosa; Oxidative stress; Dry and hot environment; desert

新疆維吾爾自治區自然科學基金項目(2015211C231)。

董翔(1982-)，男，碩士研究生。研究方向：實驗動物學。E-mail： 49834420@qq.com

劉江偉(1970-)，男，教授，博士后。研究方向：特殊環境醫學研究。E-mail： ljw273@sohu.com。

王金泉(1975-)，男，教授，博士。研究方向：動物生長發育調控。E-mail： wangjinquan163@163.com。*共同通訊

R-33

A

1671-7856(2017) 12-0028-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.12.005