兔關節軟骨細胞的體外培養及凋亡相關基因在傳代細胞中的表達

周葉 高越 王曉楠 朱立 厲蓓

兔關節軟骨細胞的體外培養及凋亡相關基因在傳代細胞中的表達

周葉 高越 王曉楠 朱立 厲蓓

目的驗證體外Ⅱ型膠原酶消化法培養兔軟骨細胞的可行性，探討凋亡及抗凋亡基因在軟骨細胞傳代中的變化，尋找關節軟骨退變老化研究的最適宜靶細胞。方法在無菌條件下取6周齡新西蘭大白兔雙側膝關節軟骨，采用Ⅱ型膠原酶消化并機械吹打的方法分離關節軟骨細胞并進行原代、傳代培養；形態學觀察時采用甲苯胺藍染色法對關節軟骨細胞進行鑒定；RT-PCR法檢測P0～P4代軟骨細胞煙酰胺磷酸核糖轉移酶（NAMPT）、信息沉默因子1（Sirt1）、p53、Bax基因的mRNA相對表達量，四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測各代關節軟骨細胞增殖情況。結果顯微鏡下觀察兔原代軟骨細胞大多呈透亮橢圓形、短梭形、多角形特征，72h全部貼壁生長。甲苯胺藍染色顯示培養的軟骨細胞細胞質染成淺藍色，細胞核染成深藍色；前3代軟骨細胞表型穩定，增殖力良好；連續培養至P4代后，絕大部分細胞變為長梭形和不規則形狀。隨著軟骨細胞的傳代，NAMPT的表達量逐漸下調。與P0代軟骨細胞相比，Sirt1的表達量在P1代細胞中明顯上調，在P2代細胞急劇下降至P0代以下，在P3～P4代細胞中Sirt1的表達量逐漸下調。凋亡基因p53和Bax的表達量隨著軟骨細胞的傳代而上調。前3代軟骨細胞增殖差異無統計學意義（均P＞0.05）；在培養到第4～7天時，P1～P3代與P4代軟骨細胞增殖差異有統計學意義（P＜0.05）。結論采用體外Ⅱ型膠原酶消化法培養兔關節軟骨細胞是切實可行的。……