長鏈非編碼RNAPVT1在神經膠質瘤組織中的表達及臨床意義

趙東孫 虎龔杰 石曉勇 陳鐘樑 陳亮 劉偉 賢湯 朱驍麻 江春 聶德康

長鏈非編碼RNAPVT1在神經膠質瘤組織中的表達及臨床意義

趙東孫 虎龔杰 石曉勇 陳鐘樑 陳亮 劉偉 賢湯 朱驍麻 江春 聶德康

目的探討長鏈非編碼RNA（LncRNA）漿細胞瘤轉化遷移基因1（PVT1）在神經膠質瘤中的表達及臨床意義。方法采用qRT-PCR方法檢測并比較53例神經膠質瘤組織（觀察組）及6例正常腦組織（對照組）中LncRNA PVT1的表達量。根據神經膠質瘤組織中LncRNA PVT1的中位表達量分為高表達組與低表達組，分析LncRNA PVT1表達量與臨床病理因素的關系。采用Kaplan-Meier法繪制不同LncRNA PVT1表達量的神經膠質瘤患者生存曲線，并分析LncRNA PVT1表達量與神經膠質瘤患者預后的關系。結果觀察組LncRNA PVT1的表達量明顯高于對照組（P＜0.01)。其中高級別膠質瘤（WHOⅢ～Ⅳ級）的LncRNA PVT1表達量明顯高于低級別膠質瘤（WHOⅠ～Ⅱ級）（P＜0.01）。LncRNA PVT1表達量與神經膠質瘤WHO分級密切相關（P＜0.01），與患者年齡、性別、Karnofsky功能狀態評分（KPS）評分、腫瘤大小等均無關（均P＞0.05）。經log-rank檢驗，高表達組患者預后較低表達組差，差異有統計學意義（P＜0.01）。結論LncRNA PVT1在神經膠質瘤組織中高表達，表達量與神經膠質瘤WHO分級及患者預后密切相關；LncRNA PVT1可能成為判斷神經膠質瘤惡性程度及預后的新型分子標記物。

神經膠質瘤長鏈非編碼RNA漿細胞瘤轉化遷移基因1預后

神經膠質瘤是神經系統最常見的原發性惡性腫瘤，占所有顱內腫瘤的40%～60%[1]。盡管外科手術、放療、化療等治療技術不斷提高，但神經膠質瘤患者的中位生存期仍然只有9～12個月[2]。因此，尋找一種新的膠質瘤分子生物學標記物，對于確定神經膠質瘤發生發展的分子機制、設計合理的個體化治療藥物、判斷預后等均有重要意義。長鏈非編碼RNA（LncRNA）是一種長度超過200nt的核苷酸分子。Han等[3]2012年首次用基因芯片證實神經膠質瘤組織與正常腦組織中的LncRNA表達差異有統計學意義，隨后關于LncRNA與神經膠質瘤的關系開始引起學者們的注意。Zhang等[4]研究表明，LncRNA與神經膠質瘤的發生、發展及分化有著密切聯系。Maher等[5]研究認為LncRNA表達異常是促進腫瘤細胞增殖、侵襲轉移的關鍵因素之一。漿細胞瘤轉化遷移基因1（PVT1）的轉錄產物屬于基因間的LncRNA，這個基因位點由Webb等[6]1984年首次在小鼠中發現。已有研究相繼證實LncRNA PVT1與肺癌、乳腺癌、肝癌、結腸癌關系密切；但其與神經膠質瘤的相關性未見報道。因此，筆者擬通過檢測神經膠質瘤組織中IncRNA PVT1的表達量，分析其與神經膠質瘤WHO分級、臨床病理因素及預后的關系，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 標本來源選擇2012年2月至2015年10月在鹽城市第一人民醫院神經外科治療的53例不同級別膠質瘤患者的腫瘤組織標本為觀察組，所有患者術前均未接受過放化療，且病例資料完整。其中男29例，女24例；年齡27～68（52.7±6.4）歲。根據神經膠質瘤WHO分級標準，低級別膠質瘤（Ⅰ～Ⅱ級）18例，高級別膠質瘤（Ⅲ～Ⅳ級）35例。另選擇2015年1至10月在浙江醫院神經外科行外傷手術的6例腦外傷患者顱內減壓組織標本為對照組，其中男4例，女2例；年齡25～49（38.3±7.1）歲。兩組患者均采取手術治療，均經病理檢查明確診斷。組織標本在手術切除離體后立即置入液氮冷凍，后轉入-80℃條件下低溫保存。所有患者均簽署知情同意書，且本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑PCR引物由北京六合華大基因科技有限公司合成提供，TRIZOL試劑購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒（Prime ScriptTMRT-PCR kit）購自大連Takara公司，Roche熒光定量試劑盒Fast Start Universal SYBR Green Master（ROX）購自上海浩然生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 總RNA提取及逆轉錄使用Trizol試劑提取53例神經膠質瘤、6例正常腦組織中的總RNA。根據逆轉錄試劑盒說明步驟，將1μg總RNA放在20μl反應溶液中進行逆轉錄反應，將cDNA凍存于-80℃冰箱備用。

1.3.2 LncRNA PVT1表達的檢測采用qRT-PCR檢測神經膠質瘤、正常腦組織中LncRNA PVT1的表達量。PVT1上游引物：5′-TGAGAACTGTCCTTACGTGACC-3；下游引物5′-AGAGCACCAAGACTGGCTCT-3′。GAPDH上游引物：5′-TTGGTATCGTGGAAGGACTCA-3′；下游引物：5′-TGTCATCATATTTGGCAGGTT-3′。按照qRT-PCR試劑盒說明書，以20μl反應體系進行擴增，陰性對照用1ml DEPC超純水代替cDNA模板。反應條件及步驟：預變性95℃30s；熱循環95℃5s，60℃30s；40個循環。溶解曲線：95℃15s，60℃1min，95℃15s。每個樣本重復3次。qRT-PCR結果用2-ΔΔCt法進行分析，所有實驗重復3次。取每個實驗Ct值的均值，以此均值計算ΔCt、-ΔΔCt、2-ΔΔCt。ΔCt=C（t待測基因）-Ct（內參基因）；ΔΔCt=ΔCt（待測樣本）-ΔCt（校準樣本）；2-ΔΔCt代表待測樣本基因表達量相對于校準樣本基因表達量的倍數。使用2-ΔΔCt值來表示PVT1在腫瘤組織、正常腦組織中的表達倍數變化。

1.4 統計學處理應用SPSS 23.0統計軟件。神經膠質瘤組織及正常腦組織中LncRNA PVT1的表達量以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；神經膠質瘤組織中LncRNA PVT1表達量與臨床病理因素的關系分析采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制不同LncRNA PVT1表達量的神經膠質瘤患者生存曲線，并采用log-rank檢驗分析LncRNA PVT1表達量與神經膠質瘤患者預后的關系。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者LncRNA PVT1的表達量比較qRT-PCR結果顯示，觀察組LncRNA PVT1的表達量為15.180±0.6336，明顯高于對照組的4.776±0.8189（P＜0.01）。其中高級別膠質瘤的LncRNA PVT1表達量為17.430±0.6368，明顯高于低級別膠質瘤的10.790±0.5724（P＜0.01），見圖1。

圖1 神經膠質瘤組織及正常腦組織中LncRNA PVT1的相對表達量

2.2 神經膠質瘤組織中LncRNA PVT1表達量與臨床病理因素的關系根據神經膠質瘤組織中LncRNA PVT1的中位表達量分為高表達組與低表達組，結果提示LncRNA PVT1表達量與神經膠質瘤WHO分級密切相關（P＜0.01），與患者年齡、性別、Karnofsky功能狀態評分（KPS）評分、腫瘤大小等均無關（均P＞0.05），見表1。

表1 神經膠質瘤組織中PVT1 RNA表達量與臨床病理因素的關系[例（%）]

2.3 LncRNA PVT1表達量對神經膠質瘤患者生存時間的影響不同LncRNA PVT1表達量的神經膠質瘤患者Kaplan-Meier生存曲線，見圖2。經log-rank檢驗，高表達組患者預后較低表達組差，差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖2 不同LncRNA PVT1表達量神經膠質瘤患者的生存曲線

3 討論

神經膠質瘤是神經系統最常見的惡性腫瘤。有研究證實神經膠質瘤存在腫瘤相關基因異質性、腫瘤易感性[7-8]。Wapinski等[9]研究證實神經膠質瘤是由1個多基因介導的相關疾病，是保持正常細胞穩定、分化和增殖的基因網絡調節異常引起的結果。Wrensch等[10]認為神經膠質瘤涉及多種癌基因的激活和抑癌基因的失活。LncRNA曾被認為是沒有功能的轉錄“噪音”[11-12]，但近年來研究表明LncRNA在轉錄水平發揮著重要作用，包括DNA甲基化、轉錄激活、轉錄的調控和轉錄干擾等[13]。在神經膠質瘤相關研究中，關于LncRNA的相關作用目前取得了一定的進展，如神經膠質瘤患者LncRNA hox轉錄反義RNA（HOTAIR）表達增高提示預后較差，且與神經膠質瘤級別的高低呈現出一定的相關性[14]。Gupta等[15]進一步研究證實，LncRNA HOTAIR-因作用于其靶基因PCR2，最終促進神經膠質瘤組織的生長。Qin等[16]實驗結果表明LncRNA TSLCA-AS1表達明顯降低，神經膠質瘤細胞的生長受到抑制，機制可能與位點基因的甲基化有關。

隨著高通量技術在基因表達中的應用，Gerstein等[17]發現PVT1基因位于染色體8q24區正義鏈上。在腫瘤細胞中，染色體8q24區也是DNA復制拷貝擴增的最高靶點，其異常擴增往往預示著腫瘤發病風險增高。如在乳腺癌、轉移性前列腺癌中，因染色體8q24區含有的多個不同核苷酸的短序列位點，其拷貝數的變異往往與前列腺癌、結腸癌等相關[18-20]。此外，在染色體8q24區還包含有多種與眾多疾病相關的風險位點，如非綜合性唇腭裂、終末期的2型糖尿病性腎病等[21-22]。LncRNA PVT1因其結構及位置的特殊性，其異常表達往往與腫瘤的形成密切相關。近年來研究表明在多種腫瘤組織（如肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、結腸癌等）或細胞系中LncRNA PVT1呈高表達，促進腫瘤細胞異常增殖、侵襲和遠處轉移，增加腫瘤細胞對化療藥物的耐受性。但LncRNA PVT1在神經膠質瘤中發生、發展的作用機制尚不清楚。本研究通過qRT-PCR檢測LncRNA PVT1在神經膠質瘤組織及正常腦組織中的表達，結果顯示神經膠質瘤組織中LncRNA PVT1的表達量明顯高于正常腦組織。結合臨床病理因素分析，發現神經膠質瘤組織中LncRNA PVT1的表達量與神經膠質瘤WHO分級密切相關，與患者年齡、性別、KPS評分、腫瘤大小等無關。因此，筆者推測LncRNA PVT1可能與神經膠質瘤患者的預后存在一定的相關性。為了證實以上推測，本研究采用Kaplan-Merier法繪制不同LncRNA PVT1表達量神經膠質瘤患者的生存曲線，并采用log-rank檢驗分析LncRNA PVT1表達量與神經膠質瘤患者預后的關系，結果發現LncRNA PVT1高表達組神經膠質瘤患者的預后較低表達組差，差異有統計學意義。

綜上所述，本研究證實LncRNA PVT1在神經膠質瘤組織中高表達，表達量與神經膠質瘤WHO分級及患者預后密切相關；推測LncRNA PVT1可能成為判斷神經膠質瘤惡性程度及預后的新型分子標記物。

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Expression of long non-coding RNA PVT1 in brain glioma and its clinical significance

ZHAO Dong,SUN Hu,GONG Jie,et al.
Department of Neurology,Zhejiang Hospital,Hangzhou 310013,China

Objective To investigate the expression of long-coding RNA(lncRNA)of plasmacytoma variant translocation gene 1(PVT1)in glioma and its clinical significance.MethodsqRT-PCR was applied to detect the expression of lncRNA PVT1 in 53 specimens of glioma(glioma group)and 6 specimens of normal brain tissues(control group).The survival curves were generated with Kaplan-Meier method.The correlation between the expression of lncRNA PVT1 and clinicopathological features,prognosis of patients was analyzed.Results The expression of lncRNA PVT1 was significantly up-regulated in glioma group compared with that the control group(P＜0.01).The expression of lncRNA PVT1 in high-grade neuroglioma(WHO III-IVgrade)was significantly higher than that in low-grade neuroglioma(WHO I-II grade)(P＜0.01).The expression of lncRNA PVT1 was significantly associated with the WHO grading of glioma(P＜0.01),but not with age,gender,Karnofsky Performance Status(KPS)score and tumor size(All P＞0.05).Log-rank test revealed that patients with high expression of lnc RNA PVT1 was significantly associated with worse prognosis compared with those with low expression(P＜0.01).ConclusionLnc RNA PVT1 is up-regulated in neuroglioma tissues.The expression of lncRNA PVT1 is closely associated with WHO grading system and prognosis of patients,indicating that lnc RNA PVT1 may serve as a novel molecular biomarker for determination of the malignant degree and prognosis of neuroglioma.

GliomaLong non-coding RNAPVT1 Prognosis

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.23.2017-1489

浙江省中醫藥科技計劃項目（2016ZQ004）；浙江省醫藥衛生科技計劃科研基金項目（2017KY179）

310013杭州，浙江醫院神經外科（趙東、孫虎、龔杰、石曉勇、陳鐘樑、陳亮、劉偉賢、湯朱驍、麻江春）；鹽城市第一人民醫院神經外科（聶德康）

聶德康，E-mail：famndk@163.com

2017-06-24）

（本文編輯：陳丹）