藏藥渣馴正丁醇部位對對乙酰氨基酚誘導的小鼠急性肝損傷的保護作用△

葉翠萍 王文倩 曹 赟 趙明明 曾 勇 古 銳

(成都中醫藥大學，四川 成都 611137)

實驗研究

△江西民族傳統藥現代科技與產業發展協同創新中心開放基金項目(JXXT201402008-1)；

△國家自然科學基金面上項目：基于分子古生物學的藏藥渣馴形成機制研究(83571699)。

藏藥渣馴正丁醇部位對對乙酰氨基酚誘導的小鼠急性肝損傷的保護作用△

葉翠萍 王文倩 曹 赟 趙明明 曾 勇 古 銳*

(成都中醫藥大學，四川 成都 611137)

目的：研究渣馴正丁醇部位對對乙酰氨基酚(APAP)誘導的小鼠急性肝損傷的保護作用。方法小鼠腹腔注射250mg·kg-1APAP制備急性肝損傷模型，檢測小鼠血清中丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)的活性；測定肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量；并做肝臟組織病理學檢查。結果與正常對照組比較，模型組小鼠ALT、AST、MDA含量明顯升高，SOD活性降低(P<0.01)，肝細胞出現明顯的變性壞死；與模型組比較，渣馴正丁醇部位中、高劑量組能夠降低急性肝損傷小鼠ALT、AST和MDA的含量，提高SOD的活性(P<0.05)。結論渣馴正丁醇部位中、高劑量組對APAP誘導的小鼠急性肝損傷具有明顯的保護作用。

渣馴;對乙酰氨基酚;急性肝損傷;保護作用

傳統藏藥渣馴，藏語發音為 Brag-zhun，藏譯音“渣”是高山及巖石的名稱， “馴” 為巖石中流出的巖汁或溶液，意譯即“巖石的精華”，簡稱“巖精”。公元8世紀的《月王藥診》中記載，“巖精能干枯膿血，主治肝病，清諸熱，誘發寒癥”[1]?！墩撜f續》中亦記載“渣馴能治療一切熱證，特別是清肝熱等”[2]。素有“肝保”和“肝膽清”美稱[3]的藏藥渣馴，是藏醫臨床治療熱性疾病的常用藥物[4]，具有1300多年的應用歷史。在藏醫臨床實踐中，用于肝熱病治療的“九味牛黃丸、五味渣馴丸(藏藥名：渣馴阿巴日布)”等藏成方制劑中均含有渣馴，渣馴在藏藥處方中的出現頻率位列第6[5]。另現代醫學研究表明渣馴具有抗氧化、清除自由基、抗炎、刺激機體再生等作用，對熱灼傷和四氯化碳處理的肝組織損傷再生有很好的治療效果[4,6]。渣馴具有明確的保肝作用，但發揮該作用的藥效物質基礎尚不明確。因此，課題組前期進行了渣馴及其提取物保肝作用的篩選研究，結果表明渣馴正丁醇部位對刀豆蛋白A(Con A)所致肝損傷保護作用較優，可能是渣馴治療肝損傷的有效物質基礎。鑒于渣馴臨床應用的廣泛性，本研究將探討渣馴正丁醇部位對APAP誘導的藥物性肝損傷的保護作用，以期為渣馴單方制劑的開發及臨床應用提供藥理學依據。

1 材料

1.1 藥物與試劑：渣馴藥材購自四川省阿壩州馬爾康縣，經成都中醫藥大學降擁四郎主任藏醫師鑒定為正品；對乙酰氨基酚(sigma國內分裝，用生理鹽水配制，可適當加熱助溶)；丙氨酸氨基轉移酶(ALT/GPT，批號：20160425)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST/GOT，批號：20160422)、超氧化物歧化酶(SOD，批號：20160502)和丙二醛(MDA，批號：20160502))試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所；冰醋酸、無水乙醇均購自于成都科龍化工試劑廠。

1.2 實驗動物：SPF級健康昆明種小鼠，雄性，體重18～22g，由成都達碩實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK(川)2013-17。適應性喂養3d，自由攝食飲水。

1.3 主要儀器：WH-3型微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；VARIOSKAN FLASH 2.4.3型全波長多功能讀數儀(美國Thermo公司)；CX41型正置顯微鏡(OLYMPUS公司)；TKD-TSB型組織脫水機(中國湖北康強醫療器械有限公司)；TB-718D型石蠟包埋機(中國湖北泰維科技實業有限公司)；RM2235型石蠟切片機(中國上海徠卡顯微系統有限公司)；DFC295-IMS型圖像分析系統(中國武漢華聯科生物技術有限公司)。

2 方法

2.1 渣馴正丁醇部位的制備：按照《藏藥炮制規范2008年版》制備渣馴膏[7]，取適量正品渣馴樣品用100℃開水浸泡并過濾3次，收集濾液后用16層紗布濾過。將得到的濾液濃縮至濃稠狀態，后將濃稠液在水浴鍋中揮至流膏狀為渣馴膏。取適量渣馴膏水溶解液用正丁醇在5000mL分液漏斗中進行萃取分離。多次萃取直到萃取層呈無色狀，得渣馴正丁醇部位。

2.2 實驗動物分組、造模及給藥：取健康昆明種雄性小鼠48只，按體重分層，隨機分為6組，每組8只：正常對照組，模型組，陽性對照組(聯苯雙酯150mg·kg-1)，渣馴正丁醇部位低、中、高劑量組(按渣馴生藥量計，分別為167mg·kg-1、333mg·kg-1、666mg·kg-1)。各組于每日上午9點開始灌胃給藥，正常對照組和模型組給予等體積的0.5%CMC-Na，其余各給藥組按劑量表給藥(見表1)，給藥體積均為0.02mL/g，連續給藥7d，1次/d。末次給藥1h后，除正常對照組腹腔注射生理鹽水外，其余各組按0.01mL/g腹腔給予250mg·kg-1APAP[8,9]制備小鼠急性肝損傷模型。

2.3 檢測指標：造模24h后，所有動物稱量體重后均摘眼球取血，制備血清用于ALT、AST的檢測。頸椎脫臼處死小鼠，摘取肝臟，冰生理鹽水漂洗，濾紙吸干后稱重，用于計算小鼠肝臟指數，同時肉眼觀察肝臟外觀變化；取部分肝左葉制備肝組織勻漿，用WST-1法測定肝中超氧化物歧化酶(SOD)含量；用TBA法測定肝中丙二醛(MDA)含量；另取肝大葉固定于10%的中性甲醛溶液中用于蘇木精-伊紅染色(HE染色)，光鏡下觀察肝臟組織病理變化。

3 結果

3.1 渣馴正丁醇部位對小鼠肝臟指數的影響：與正常對照組比較，模型組小鼠肝臟眼觀可見明顯的壞死，腫大，肝臟指數明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，渣馴正丁醇部位各給藥組肝臟指數有下降趨勢，但無統計學差異。結果見表1。

表1 渣馴正丁醇部位對小鼠肝臟指數的影響

注:與正常對照組比較，#P<0.05。

3.2 渣馴正丁醇部位對小鼠血清中ALT、AST的影響：與正常對照組比較，模型組小鼠血清ALT、AST活性顯著升高(P<0.01)，表明小鼠急性肝損傷模型復制成功。給予不同劑量的渣馴正丁醇部位，ALT和AST水平較模型組均有不同程度的降低，且隨著劑量的增加，下降趨勢更為明顯。其中渣馴正丁醇部位中、高劑量組ALT、AST活性下降明顯(P<0.05)。結果見表2。

表2 渣馴正丁醇部位對小鼠血清中ALT、AST的影響

注:與正常對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 渣馴正丁醇部位對小鼠肝組織中SOD、MDA含量的影響：與正常對照組比較，模型組SOD活性下降，MDA含量增加，差異具有顯著統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，渣馴正丁醇部位中、高劑量組SOD活性增加，MDA含量下降明顯(P<0.05)；低劑量組SOD、MDA含量有下降趨勢，但不具有統計學差異。結果見表3。

表3 渣馴正丁醇部位對小鼠肝組織中SOD、MDA的影響

注:與正常對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.4 小鼠肝組織病理變化：由圖1可知，正常對照組，肝組織結構清晰，未見明顯異常。模型組可見肝臟廣泛壞死伴淤血，肝臟結構不清，細胞核固縮、凋亡，匯管區見少量炎細胞浸潤；聯苯雙酯組，局部匯管區水腫伴有少量炎細胞浸潤，余未見明顯異常；渣馴正丁醇部位各劑量組，隨著劑量的增加，肝細胞壞死、變性和炎癥細胞浸潤的程度相應減輕。

4 討論

藥物性肝損傷(drug induced liver injury，DILI)是指在應用藥物過程中由藥物或其代謝產物引起的肝臟疾病[10]。近年來，隨著醫學的發展，各種新型藥物不斷上市，臨床用藥種類逐漸增多，以及人們保健意識的不斷增強，DILI的發生率逐年上升并成為引發肝病的重要原因之一，并成為一個嚴重的公共衛生問題。據世界衛生組織統計，全球死亡原因的第五位已被DILI所占據。目前已有1100多種藥物可引起DILI[11]。根據Hy′s法則[12]，死亡風險至少為10%，Ou等[13]的研究中可達12.69%。因此，研發有效的保肝藥物依然是當今藥物研究的熱點和難題。

對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)是一種常見的解熱鎮痛藥，臨床應用實踐表明，大劑量或者長期服用，?？蓪е赂螕p傷等嚴重的不良反應。因此，APAP成為建立藥物性肝損傷模型的常用藥物，其血清學指標ALT、AST是反應肝實質損害常見的主要指標。本實驗研究中，模型組小鼠血清中ALT、AST含量均顯著增高(P<0.01)，表明模型建立成功。而各給藥組在給予不同劑量的渣馴正丁醇部位后，ALT、AST、MDA含量降低，SOD活性增加，且呈現劑量依賴關系，以渣馴正丁醇部位中、高劑量組效果尤為顯著(P<0.05)。此外，小鼠肝臟組織病理學檢查結果表明，渣馴正丁醇部位3個劑量組隨著給藥劑量的增加，肝細胞壞死、變性及細胞浸潤程度相應的降低，表明渣馴正丁醇部位對APAP所致的肝損傷有一定的保護作用，但其具體作用機制有待進一步研究。

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[4]木拉提·克扎衣別克. 塔斯馬依的研究進展[J]. 中國中藥雜志,2013, 38(3):443-447.

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[13]Ou P,Chen Y,Li B,et al. Causes,clinical features and outcomes of drug induced liver injury in hospitalized patients in a Chinese teriary care hospital[J]. Springerplus, 2015, 4: 802.

葉翠萍，女，在讀研究生，從事中藥的藥效與毒理研究；E-mail: 460323715@qq.com。

*通訊作者：古銳，男，副研究員，從事民族藥可持續開發與利用研究；E-mail: 664893924@qq.com，Tel: 15108237310。

R291.4

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1006-6810(2017)05-0060-03

2017年1月17日收稿