丹參乙酸鎂減輕腦缺血/再灌注誘導的神經細胞凋亡作用及機制

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(1.長沙醫學院藥學院，湖南 長沙410219； 2.湖南九典制藥股份有限公司；3.上海修實生物科技有限公司)

·基礎醫學·

丹參乙酸鎂減輕腦缺血/再灌注誘導的神經細胞凋亡作用及機制

婁崢1,周雅倩1,徐獻1,雷文枚2,任賢1,3*

(1.長沙醫學院藥學院，湖南 長沙410219； 2.湖南九典制藥股份有限公司；3.上海修實生物科技有限公司)

目的探討丹參乙酸鎂對于大鼠腦缺血/再灌注損傷中的保護作用及其機制。方法動物實驗采用大鼠線栓法缺血/再灌注模型，使大鼠腦缺血2 h后，再灌注24 h。細胞實驗采用NG108-15神經細胞株缺氧/復氧模型，低氧無糖培養2 h后，復氧24 h。檢測神經細胞凋亡、NADPH氧化酶 (NOX)活性及H2O2水平。結果

與模型組比較,丹參乙酸鎂組大鼠腦組織神經細胞凋亡明顯下降,NOX活性和H2O2水平均降低。結論丹參乙酸鎂具有抗腦缺血/再灌注損傷的作用,其機制與抑制NOX活性，減少H2O2生成有關。

丹參乙酸鎂； 缺血/再灌注； 氧化應激

臨床治療過程中對于缺血性腦卒中通常使用組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator，t-PA)進行溶栓，給藥使其恢復血液灌流后，除缺血外，再灌注本身也能給腦造成損傷，統稱為缺血/再灌注損傷 (cerebral ischemia reperfusion injury,CI/R)。氧化應激是指機體活性氧(reactive oxygen species，ROS)產生過多和/或抗氧化能力降低，使得ROS 在細胞內大量蓄積而導致細胞凋亡、壞死的氧化損傷過程[1]，是造成腦缺血/再灌注損傷的機制之一。

丹參多酚酸鹽是中藥丹參的水溶性提取物，已用于輔助治療心絞痛等缺血性心臟病，其中丹參乙酸鎂是其主要藥理活性成分[2]。丹參乙酸鎂具有抗血小板聚集作用，對血管栓塞性疾病缺血期即發揮溶栓治療作用，同時在再灌注期具有良好的抗氧化特性。基于氧化應激是導致腦缺血/再灌注損傷的重要機制之一，本研究擬探討丹參乙酸鎂對腦缺血/再灌注誘導的神經凋亡作用及機制。

1 材料與方法

1.1材料健康雄性SD大鼠，體重 250～300 g，中南大學實驗動物學部提供。NG108-15細胞株(小鼠神經細胞瘤與大鼠神經膠質瘤融合細胞株)購于中國科學院上海生命科學研究院。實驗儀器：組織包埋機(LEICA)、石蠟切片機(LEICA)、生化培養箱(Thermo)、多功能酶標儀(Beckman)。實驗試劑：丹參乙酸鎂(上海綠谷制藥股份有限公司)、依達拉奉(中國計量科學研究院)、Caspase-3活性檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)、NADPH氧化酶(NADPH oxidase，NOX)活性試劑盒(杰美基因醫藥科技有限公司)、VAS2870(NOX特異性抑制劑，Sigma)、TUNEL原位雜交試劑盒(Roche)。

1.2方法動物實驗：構建線栓法腦缺血/再灌注(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型[3]：10%水合氯醛腹腔麻醉實驗動物后，暴露并分離左側頸總動脈(CCA)，頸外動脈(ECA) 和頸內動脈(ICA)。結扎CCA近心端及ECA，用動脈夾暫時夾閉ICA。于CCA遠心端放置一打好結的備用絲線，在此線下端剪一小口，將MCAO栓線(購于北京沙東生物技術有限公司，栓線頭部直徑為0.40±0.02 mm)插入至頸內動脈，收緊絲線，放開ICA上的動脈夾，順ICA 將栓線送至顱內，從CCA分叉處算起，插入深度為約20 mm。阻斷血流2 h后，栓線取出以實現再灌注，同時將備用線結扎CCA遠心端，并縫好皮膚，再灌注24 h后處理動物。

54只SD大鼠隨機平均分為以下6組：正常對照組(Control組)：不作任何處理；假手術組(Sham組)：分離出CCA、ECA和ICA，不插入栓線；腦缺血再/灌注組(I/R組)：缺血2 h，再灌注24 h；丹參乙酸鎂+腦缺血/再灌注組(I/R+MLB組)：再灌注后30 min舌下靜脈給藥(用量：20 mg/kg 0.9%NaCl溶解)；依達拉奉+腦缺血/再灌注組(I/R+Edaravone組)：再灌注后30 min舌下靜脈給藥(用量：6 mg/kg 溶于60 ℃0.9%NaCl溶液)；溶媒+腦缺血/再灌注組(I/R+Vehicle組)：再灌注后30 min舌下靜脈給藥0.9%NaCl溶液。

處死動物后橫切一部分腦組織做TUNEL染色等組織學檢驗，取缺血側腦組織檢測Caspase-3酶活性、NOX活性、H2O2含量等生物化學檢驗。

細胞實驗[4]：構建缺氧/復氧模型(H/R)：接種NG108-15細胞株于6孔板或12孔板中，待其貼壁以后，棄掉正常培養的12%血清高糖培養基，孔內滴入無血清高糖培養基繼續常溫常氧培養12～18 h而使細胞周期同步化。細胞周期同步化后棄掉無血清培養基，滴入滅菌平衡鹽溶液，放入低氧(1%)37 ℃培養箱中培養2 h，即低氧無糖處理。棄掉平衡鹽溶液，繼續使用12%血清高糖培養基常溫常氧培養箱中培養24 h，即復氧處理。復氧過程后按照不同檢測方法進行相關檢測。

實驗分組：正常對照組(Control組)：同步化后2 h改用12%血清高糖培養基培養；缺氧/復氧模型組(H/R組)：按上述方法造模；丹參乙酸鎂+缺氧/復氧組(H/R+MLB組)：在造模復氧階段，在培養基中加入丹參乙酸鎂溶液，濃度為10-5mol/L；依達拉奉+缺氧/復氧組(H/R+Edaravone組)：在造模復氧階段，在培養基中加入以0.1%DMSO溶解的濃度為10-5mol/L依達拉奉(不溶于37 ℃培養基)；VAS2870+缺氧/復氧組(H/R+VAS2870組)：在造模復氧階段，在培養基中加入以0.1% DMSO溶解濃度為10-5mol/L的VAS2870(不溶于37℃培養基)；溶媒組+缺氧/復氧組(H/R+Vehicle組)：在造模復氧階段，在培養基中加入0.1%DMSO。H/R處理后，進行Hoechst染色檢測細胞凋亡程度、測定NOX活性以及H2O2含量等生物化學檢驗，每組進行6次獨立實驗。

1.3細胞凋亡檢測腦組織細胞凋亡采用TUNEL染色。凋亡細胞使得內源性核酸內切酶激活，細胞DNA在內切酶作用下出現斷裂，隨之出現單鏈或雙鏈DNA缺口，并產生與DNA斷點數目相當的3′-OH末端。暴露的3′-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT) 的催化下加上熒光素(FITC) 標記的dUTP (fluorescein-dUTP)，形成不溶性的深藍色至藍紫色的NBT-formazan。顯微鏡觀察，細胞核深藍色至藍紫色顆粒者為TUNEL陽性細胞，每張切片各取5個不重疊視野，統計陽性細胞數(每平方毫米的TUNEL陽性細胞數目)，數目越多則表明細胞凋亡越多。具體步驟按試劑盒廠家提供的說明進行(Roche公司，瑞士)。

NG108-15神經細胞的凋亡檢測采用Hoechst染色。Hoechst 33258染色凋亡細胞，由于染色質會固縮，在熒光顯微鏡下觀察，凋亡細胞的細胞核會呈碎塊狀致密濃染或呈致密濃染，顏色相對正常細胞顏色呈白色。每組每樣本隨機選取3個視野，計算細胞凋亡率(凋亡細胞數量/總細胞數量)。

1.4 Caspase-3活性檢測Caspase-3活性是反映細胞凋亡的重要指標。Caspase-3酶可催化底物Ac-DEVD-pNA產生黃色的pNA，通過測定pNA吸光度可計算Caspase-3活性。一個酶活性單位定義為當底物飽和時，在37 ℃可以催化1 nmol Ac-DEVD-pNA生成1nmol pNA的Caspase-3的酶量。腦組織Caspase-3活性檢測具體步驟按試劑盒廠家提供的說明進行(碧云天生物技術研究所，江蘇南京)。

1.6 H2O2水平檢測H2O2是NOX下游的重要氧化物，也是造成細胞損傷的重要活性氧。按廠家提供標準品制備標準曲線，在將腦組織勻漿液和NG108-15神經細胞裂解液與試劑盒工作液反應，于酶標儀540 nm檢測吸光度值，再根據標準曲線計算出樣品中H2O2水平，詳細步驟按試劑盒廠家提供的說明進行(碧云天生物技術研究所，江蘇南京)。

1.7統計分析采用SPSS20.0軟件，數據表示均為均數±標準差，多組均數比較采用ANOVA及Bonferroni’s多重比較t檢驗分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1丹參乙酸鎂對缺血/再灌注大鼠腦組織細胞凋亡的作用見圖1。對照組和假手術組腦組織中幾乎未見陽性細胞，缺血/再灌注組TUNEL陽性細胞明顯增加。

圖1 丹參乙酸鎂對缺血/再灌注誘導的神經細胞凋亡的影響(n=6) A:顯微鏡下TUNEL染色陽性細胞(200×);B:顯微鏡下TUNEL染色陽性細胞數量；C:Caspase-3相對活性. 與Sham比較,**:P<0.01;與I/R比較，++:P<0.01

凋亡細胞核固縮，細胞核染成深藍色至藍紫色顆粒。給予丹參乙酸鎂后， TUNEL陽性細胞數目顯著減少(P<0.01)。陽性對照藥依達拉奉也能顯著降低TUNEL陽性細胞數目(圖1B)。缺血/再灌注組腦組織Caspase-3活性顯著升高，給予丹參乙酸鎂或依達拉奉可以顯著降低Caspase-3活性(P<0.01，圖1C)，該結果與TUNEL結果一致。丹參乙酸鎂的溶媒(生理鹽水)對TUNEL染色和Caspase-3活性均明顯無影響。

2.2丹參乙酸鎂對缺血/再灌注大鼠腦組織NOX活性和H2O2生成的影響如圖2所示，對照組和假手術組腦組織NOX活性和H2O2含量無顯著差別，排除了造模手術本身影響。缺血/再灌注組腦組織NOX活性和H2O2含量較假手術組有顯著升高。給予丹參乙酸鎂或陽性對照藥依達拉奉可以顯著降低NOX活性和H2O2含量，而溶媒生理鹽水對NOX活性和H2O2含量均明顯無影響。

2.3丹參乙酸鎂對低氧/復氧誘導的NG108-15神經細胞凋亡的作用如圖3A所示，對照組Hoechst染色陽性細胞較少，低氧/復氧組Hoechst染色陽性細胞明顯增加(箭頭所示)。丹參乙酸鎂、依達拉奉或NOX特異性抑制劑VAS2870處理后Hoechst染色陽性細胞較低氧/復氧組顯著減少(圖3B)。丹參乙酸鎂溶媒對Hoechst染色無明顯影響。

2.4丹參乙酸鎂對低氧/復氧處理的NG108-15神經細胞NOX活性和H2O2生成的影響如圖4所示，低氧/復氧組NG108-15神經細胞NOX活性和H2O2水平較對照組顯著升高。丹參乙酸鎂、依達拉奉及NOX特異性抑制劑VAS2870處理后可顯著降低NOX活性和H2O2水平。1%DMSO溶媒對NOX活性和H2O2生成無明顯影響。

圖2 丹參乙酸鎂對缺血/再灌注大鼠腦組織NOX活性和H2O2生成的影響(n=6)A：NOX活性;B:H2O2水平 與Sham比較，**:P<0.01;與I/R比較，++:P<0.01

圖3 丹參乙酸鎂對低氧/復氧誘導的NG108-15神經細胞凋亡的影響(n=6)A:細胞學形態學(200×)；B:凋亡率相對百分數 與Control比較，**:P<0.01;與H/R比較，++:P<0.01

圖4 丹參乙酸鎂對低氧/復氧處理的神經細胞中NOX活性和H2O2生成的影響(n=6)A:NOX活性;B:H2O2濃度 與Control比較，**:P<0.01;與H/R比較，++:P<0.01

3 討 論

氧化應激是腦缺血/再灌注損傷所涉及的重要機制之一，抗氧化劑依達拉奉可以改善腦卒中后中樞神經功能，減輕癥狀，恢復意識和行動能力[5]。但依達拉奉對于肝、腎等重要臟器有嚴重的不良反應，極大的限制了該藥在臨床上的使用，僅有日本和歐洲少數國家批準上市。

以丹參乙酸鎂為主要成分的丹參多酚酸鹽注射劑是一個抗腦缺血/再灌注的理想候選藥物，現階段已經作為一個上市藥物廣泛的用于心血管疾病的治療，如動脈粥樣硬化、心肌缺血等，其機制涉及到抗炎、抗氧化、抗血小板等作用[6]。臨床循證醫學發現，丹參多酚酸鹽對于腦卒中有一定的輔助治療作用，但其作用機制尚不清楚。

本研究使用大鼠在體線栓法腦缺血/再灌注模型，通過減少腦動脈血流量，造成一側腦部供血不足，在拔除栓線以后，其腦動脈血流可以恢復到造模前80%左右，腦梗死區域明顯，神經功能損傷嚴重。該模型廣泛用于模擬缺血性腦卒中的發生與恢復供血治療過程。在術后給予丹參乙酸鎂和依達拉奉后，通過TUNEL染色檢測神經細胞凋亡情況，可以觀察到對照組與假手術組TUNEL陽性細胞基本沒有出現，而在腦缺血/再灌注模型組，TUNEL陽性細胞明顯增多，在給予丹參乙酸鎂以及依達拉奉以后，TUNEL陽性細胞有所降低，陽性細胞顆粒顏色變淺。在細胞水平，Hoechst染色實驗也證明在給予丹參乙酸鎂、依達拉奉后同樣可以減少低氧/復氧模型所造成的神經細胞凋亡。以上實驗說明丹參乙酸鎂可以通過維持神經細胞正常形態、減少細胞凋亡等方面有效保護腦卒中發生與治療過程中的腦缺血/再灌注損傷，表明丹參乙酸鎂與陽性藥依達拉奉的保護程度相似，其機制可能與抑制氧化應激有關。

綜上所述，本研究結果表明丹參乙酸鎂具有抗腦缺血/再灌注誘導神經細胞凋亡作用，其機制與抑制NOX活性，減少ROS生成有關。

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EffectofmagnesiumlithospermateBoncerebralischemia/reperfusion-inducedapoptosisandtheunderlyingmechanisms

LOU Zheng,ZHOU Yaqian,XU Xian,et al

(CollegeofPharmacy，ChangshaMedicalUniversity,Changsha410219，Hunan,China)

ObjectiveTo investigate whether lithospermate B is able to protect the rat brain from ischemia/reperfusion injury and the underlying mechanism.MethodRats were subjected to 2 h of cerebral ischemia and 24 h of reperfusion to establish anischemia/reperfusion injury model.In a NG108-15 nerve cell hypoxia/reoxygenation (H/R) injury model,cells were cultured in 2 h of hypoxia and 24 h of reoxygenation.And cellular apoptosis,nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase (NOX)activity,and H2O2content were examined.ResultAdministration of salvia magnesium lithospermate B reduced apoptosis of nerve cells with a decrease in nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase activity and H2O2production in the rat brains,compared with model group.In the experiments,the number of iHoechst staining positive cells,nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase activity and H2O2level were decreased by the intervention of drugs.ConclusionThe results suggest that lithospermate B is able to protect the brain from ischemia/reperfusion oxidative injury,which is related to the inhibition of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase and a reduction of reactive oxygen species production.

magnesium lithospermate B; ischemia/reperfusion injury; oxidative stress

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.05.009

2016-12-01；

2017-07-26

湖南省教育廳一般項目(15C0161)藥學類專業校企合作人才培養示范基地(湘教通[2014]272號).

*通訊作者，E-mail：renxian87@163.com.

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蔣湘蓮)