絲裂霉素對胃癌細胞SGC-7901miRNA表達譜的影響

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(1.南華大學醫學院診斷學教研室，湖南 衡陽 421001；2.南華大學附屬第二醫院消化內科；3.南華大學附屬第二醫院藥劑科)

·基礎醫學·

絲裂霉素對胃癌細胞SGC-7901miRNA表達譜的影響

謝娟1，唐霞2，李國慶2，劉艷萍2，李熠1，馮聚玲1，許麗芳1，王超3*

(1.南華大學醫學院診斷學教研室，湖南 衡陽 421001；2.南華大學附屬第二醫院消化內科；3.南華大學附屬第二醫院藥劑科)

目的分析絲裂霉素(MMC)治療對胃癌細胞miRNA表達譜的影響，為MMC的胃癌治療機制提供理論參考。方法體外培養胃癌SGC-7901細胞，根據噻唑蘭(MTT)法評估MMC的作用效果和作用濃度；利用miRNA芯片技術評估MMC干預后SGC-7901的miRNA表達譜改變，并通過qRT-PCR驗證差異表達miRNA。結果SGC-7901細胞生長抑制率與MMC作用濃度間存在正相關；MMC干預48 h后SGC-7901細胞有59個miRNA出現表達改變，與正常胃黏膜上皮細胞GES-1相比，SGC-7901胃癌細胞的miR-205*和miR-3924等11個miRNAs表達上調，而miR-498,miR-18b,miR-196b,miR-1247等22個miRNA表達下調；經MMC干預后，部分異常表達得到恢復。結論MMC可能調控miR-498在內的59個miRNA在胃癌細胞的表達。

絲裂霉素； MiRNA表達譜； 胃癌； SGC-7901

微小RNA(microRNA,miRNA) 是近年發現的一類非編碼小分子RNA，可在轉錄后水平調控腫瘤相關基因的表達[1-2]。腫瘤細胞中miRNA的異常改變，可影響下游癌基因或抑癌基因的表達水平或功能，進而發揮促癌或抑癌作用[1]。研究證實miR-21可促進胃癌細胞的增殖及侵襲,miR-375作為腫瘤抑制因子可影響胃癌細胞的增殖，而miR-218在體內外模型均可抑制胃癌細胞的侵襲和轉移[3-5]。腫瘤細胞經抗癌藥物治療后miRNA表達譜可隨之改變[6]。絲裂霉素(MMC)參與的多種化療藥物的綜合應用是治療中晚期胃癌的重要手段之一[7]。張輝等[8]研究發現乳腺癌細胞經MMC作用后，miRNA表達譜發生了明顯改變。目前胃癌細胞經過MMC作用后的miRNA表達譜尚無相關報道。本文初步探討了MMC對胃癌細胞SGC-7901增殖的抑制功能，獲得了與胃癌相關的miRNA表達譜及經MMC作用后改變的miRNA表達譜，這些結果可為后續胃癌的發生發展研究提供參考。

1 材料與方法

1.1細胞培養SGC-7901人胃癌細胞和正常人胃黏膜上皮細胞GES-1細胞(中國科學院，上海，中國)培養于RPMI-1640培養基(GIBCO，長島，NY，USA)，另含2 mmol/L-谷氨酰胺(上海生工生物工程有限公司,上海，中國)，10%胎牛血清(HyClone,UT，USA)，50 U/mL青霉素和50 mg/鏈霉素。以密度為1×105個/mL鋪于6孔培養板，置于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育。當細胞融合達到50%后，換用新培養基培養過夜。給藥前另用無血清RPMI-1640培養基(Sigma-Aldrich，上海，中國)孵育12 h。

1.2 MTT實驗MTT測定法步驟參照制造商(Sigma-Aldrich，上海，中國)說明書。將5×104個/mL接種于96孔板，培養至細胞貼壁生長后棄去培養液，加入用不含血清培養液配制的不同濃度的MMC(0.187 μmol/L，0.374 μmol/L，0.748 μmol/L，1.496 μmol/L和2.991 μmol/L)，對照組細胞中為不加藥物的無血清培養液，每組設5個復孔，空白對照組為不含細胞的等量溶劑。37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養4 h后，棄去上清，加入150 μL二甲基亞砜終止反應。采用酶聯免疫儀(PerkinElmer,CA,USA)于570 nm波長測定每孔吸光度(A值)。生長抑制率計算公式為：生長抑制率(E)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。MMC作用48 h后的IC50濃度為抑制SGC-7901 細胞半數的濃度。

1.3基因芯片人胃癌細胞株SGC-7901經不同處理后加入1 mL TRIzol裂解液(Invitrogen,CA,USA)提取總RNA。待測RNA通過NanoDropTMfluorospectrometer(Thermo Scientific,Delaware,USA)在260 nm/280 nm處測得的OD值評估濃度和豐度，并通過1%變性瓊脂糖凝膠電泳評估RNA完整性。微RNA通過miRNA分離試劑盒(Invitrogen,CA,USA)收集，并采用miRCURYTMArray Power試劑盒(Exiqon,Denmark)將miRNA標記上HyTM熒光基團；在MAUI雜交系統(BioMicro,Salt Lake City,USA)，標記的miRNA與miRCURYTM芯片完成雜交。用Axon GenePix 4000B芯片掃描儀(AxonInstruments,Foster City,CA,USA)采集熒光強度，并使用GenePix pro V6.0軟件(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)進行數據分析，上述基因芯片處理由上?？党缮锕こ逃邢薰緟f助完成。將各數據做標準化處理。計算相應miRNA分子的表達倍數(FC,Fold Change)，設FC≥2.0或≤0.5為差異表達標準。

1.4 qRT-PCR 總RNA采用逆轉錄試劑盒(PrimeScriptTMreagentkit，TaKaRa，Japan)逆轉錄為cDNA。采用的qRT-PCR反應液含0.5 μL 10 μmol/L的PCR特異性引物，0.5 μL的2×Master Mix，5 μL的10 μmol/L的PCR特異性引物，加水至總體積為8 μL；混合后加到384-PCR板，并加入2 μL cDNA；于Realtime PCR儀(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany),95 ℃下預變性10 min，隨后的40個PCR循環如下：95 ℃，10 s；60 ℃，60 s。擴增反應結束后，從60 ℃緩慢加熱到99 ℃生成熔解曲線。目的miRNA和內參(U6)的數據采用2- △△CT法計算。ΔΔCT=ΔCT SGC-7901(MMC干預后)-ΔCT SGC-7901，ΔCT=CT miRNA-CT U6。Ct是反應時熒光強度達到設定閾值所經過的擴增循環數。見表1。

表1 qRT-PCR引物表

1.5統計學分析統計學分析處理軟件為統計學軟件版本SPSS13.0 (SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)，所得到的計量資料用均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差(ANOVA)分析以及采用LSD法行兩兩比較，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 MMC抑制胃癌細胞SGC-7901的活性MTT實驗表明0.187、0.374、0.748、1.496、 2.991 μmol/L MMC對胃癌細胞株SGC-7901的增殖抑制率分別為(21.3±1.5)%、(27.3±1.6)%、(45.3±1.5)%、(54.5±0.5)%和(63±0.1)%。隨著MMC作用濃度的升高，SGC-7901的增殖抑制率也隨之增高。MMC抑制SGC-7901增殖的IC50值為1.33 μmol/L(圖1)。

圖1 MMC 干預SGC-7901細胞48 h后細胞的存活情況與對照組比較，*：P<0.05

2.2 MMC調控SGC-7901的miRNA表達譜SGC-7901經過MMC干預后有60種miRNA出現差異表達,刪去表達改變倍數絕對值小于1的miRNA [即log2(FC)<1]，尚包括38個顯著上調的miRNA，21個顯著下調的miRNA。與正常胃黏膜上皮細胞GES-1相比，SGC-7901胃癌細胞的miR-205*和miR-3924等11個miRNAs表達上調，而miR-498,miR-18b,miR-196b,miR-1247等22個miRNA表達下調，經MMC藥物干預后，該異常表達可部分恢復(圖2A)。此外，與GES-1相比較，在SGC-7901細胞中表達下調的miR-622,miR-7和miR-877等6個miRNAs，表達上調的miR-296-5p,miR-943和miR-1284等13個miRNAs的表達水平在MMC藥物干預前后無明顯變化(圖2B)。而在SGC-7901細胞中表達無改變的miR-3926,miR-3074-3p和miR-H5-3P等7個miRNAs在經過MMC處理后，出現了表達的改變(圖2C)。

2.3實時熒光定量qRT-PCR驗證芯片結果將miRNA芯片檢測結果與qRT-PCR 結果進行比較，與正常胃黏膜GES-1細胞相比，SGC-7901的miR-7、miR-185、miR-33b、miR-16的表達倍數在芯片結果中分別為0.24、0.215、0.275和2.288，在qRT-PCR結果中表達倍數分別為0.38、0.34、0.64和1.50。在MMC 干預的SGC-7901細胞中，miR-498 和miR-3924 的表達倍數在芯片結果中為13.067 和0.334，在qRT-PCR 結果中表達倍數分別為8.46 和0.38。qRT-PCR 結果與miRNA 芯片結果的趨勢一致，進一步驗證了芯片結果(圖3)。

3 討 論

相關研究已證實，miRNA的異常表達在胃癌的發生發展中發揮重要作用[9]。本文對比了SGC-7901胃癌細胞與GES-1正常胃黏膜細胞的miRNA表達譜，發現在SGC-7901細胞中miR-3924、miR-498和miR-1247等33個miRNA的表達存在異常；該結果包括了已報道的miR-205*，新成員如miR-498，但未包括已經報道的miR-221和miR-222等，這可能與胃癌機制的復雜易變性有關。

近年來，學者們對miRNA與化療藥物效應展開了相關研究。早期的研究大多集中在增強藥物敏感性和對抗藥物耐藥性上。有報道在胃癌細胞系SGC-7901中發現miR-221 和miR-222 的表達明顯上調，敲除其編碼基因后可明顯抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲，并增加對放化療治療的敏感性,其作用機制可能與調控PTEN基因有關[10]。Zhu等[11]研究發現miR-200bc/429可通過靶向調控BCL2和XIAP的表達在胃癌和肺癌細胞株對抗癌藥物的多重耐藥性中發揮重要作用。學者們又陸續通過研究發現抗癌藥物能改變腫瘤細胞的miRNA表達譜，Shah MY等[12]研究報道MCF-7乳腺癌細胞經過5-FU處理后，出現了23個上調和19個下調的miRNA[12]。Zhou等[13]研究發現，結腸癌細胞HCT-8和HCT-116經5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑藥物處理后，miRNA表達譜發生改變，在腫瘤細胞中高表達的miR-197，miR-191，miR-92a，miR-93，miR-222和miR-1826均出現了明顯下調。

絲裂霉素作為治療胃癌藥物化療中的手段之一，目前尚無報道其可影響胃癌細胞miRNA的表達譜。本文使用不同濃度的MMC處理胃癌細胞SGC-7901后，發現MMC可有效抑制胃癌細胞SGC-7901的增殖，并且可顯著影響胃癌細胞miRNA的表達。經MMC藥物作用后，SGC-7901的miRNA表達譜出現59個miRNA的差異表達，其中38個顯著上調，21個顯著下調。此外，與正常胃黏膜上皮細胞相比，SGC-7901胃癌細胞的miR-205*和miR-3924等11個miRNAs表達上調，而miR-498,miR-18b,miR-196b,miR-1247等22個miRNA表達下調，在經過MMC藥物干預后，部分異常表達得到恢復。其中miR-498是我們在本次研究中新發現的在胃癌中異常表達的新成員，此前在胃癌中并未見相關報道。目前，miR-498在其它腫瘤中異常表達的報道并不多，有研究發現miR-498在非小細胞性肺癌、結直腸腺癌中低表達[14-15]。而在乳腺癌中高表達[16]。本文結果顯示miR-498在SGC-7901胃癌細胞中表達水平明顯下調，經MMC作用后該異常表達可恢復；這提示miR-498可能參與了MMC的抑癌機制。本文采用的SGC-7901源自一位胃腺癌患者的淋巴結轉移灶，為中度分化胃腺癌細胞,因結果重復性好被廣泛應用；在進一步研究中，將繼續在臨床患者和其他腫瘤細胞系中驗證上述結果。

圖2 SGC-7901經MMC作用后miRNA的差異表達譜A：兩個表達譜中改變趨勢不同的miRNAs;B：兩個表達譜中改變趨勢相同的miRNAs；C：僅在經過MMC處理后在SGC-7901細胞中差異表達的miRNAs. 縱坐標為miRNA表達水平的Log2(FC)值，FC為miRNA的表達改變值

圖3 qRT-PCR 驗證miRNA芯片結果A：qRT-PCR 驗證胃癌細胞系SGC-7901與正常胃黏膜上皮細胞GES-1比較的miRNA表達譜結果；B：qRT-PCR 驗證SGC-7901經過MMC處理后，SGC-7901細胞的miRNA表達譜結果. 縱坐標為miRNA表達水平的改變倍數

總之，研究表明胃癌細胞中miRNA可出現異常表達，miR-498等miRNA在胃癌細胞內表達水平明顯改變，而經MMC藥物干預后，該異常表達水平可出現部分恢復，這提示MMC可能通過調控miR-498等miRNA的表達發揮抑癌作用。

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MicroRNAprofilingofgastriccancerSGC-7901aftermitomycinCtreatment

XIE Juan,TANG Xia,LI Guoqing,et al

(DepartmentofDiagnostics,MedicalCollegeofUniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo evaluate the mitomycin C (MMC) treatment on the miRNA expression profile in gastric cancer cells,and provide the theoretical evidences for MMC treatment on gastric cancer.MethodsThe effects and optimum concentration of MMC were evaluated in the cultured SGC-7901 cells by MMT. The miRNA microarray technique was used for the exploration of miRNA profile of SGC-7901 cells after MMC treatment and the different expression of candidate miRNA was further confirmed by qRT-PCR.ResultsThe inhibition rate of SGC-7901 cells was negatively correlated with the MMC concentration. The 60 miRNAs have changed expression in SGC-7901 cells 48 hours after MMC treatment. Among them,11 miRNAs included miR-498 and miR-1247 were up-regulated,and miR-205*and miR-3924 were down-regulated. Some abnormal expression changes recovered after MMC treatment.ConclusionMMC can regulate the expression of 60 miRNAs including miR-498 in gastric cancer cells.

mitomycin; miRNA expression profile; gastric cancer; SGC-7901

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.02.005

2016-10-28；

2016-02-10

湖南省教育廳科學研究項目(16C1401)資助，湖南省教育廳優秀青年基金項目(13B098)資助.

*通訊作者，E-mail：317249741@qq.com.

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