表皮松解性掌跖角化病一家系KRT9基因突變檢測及生物信息學分析

湯莊力 王 添 肖生祥 王曉鵬

表皮松解性掌跖角化病一家系KRT9基因突變檢測及生物信息學分析

湯莊力 王 添 肖生祥 王曉鵬

目的檢測表皮松解性掌跖角化病1家系KRT9基因突變情況并進行生物信息學分析。方法提取家系患者、正常人及100名健康志愿者外周血DNA，采用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增KRT9基因全部外顯子并測序。與數據庫比對測序結果，運用生物信息學軟件進行突變型蛋白質結構及功能預測分析。結果患者KRT9基因1號外顯子內檢測到一處c.487C>T錯義突變(p.163R>W)，家族未患病成員以及100名正常對照中未發現突變。生物信息學分析提示該突變會導致蛋白質二級結構和理化性質改變，功能分析提示該突變會改變蛋白質生物功能。結論本家系檢測到1個KRT9基因的熱點突變，該突變對于疾病發生發展可能具有較大作用。

表皮松解性掌跖角化病； KRT9基因； 基因突變檢測； 生物信息學分析

表皮松解性掌跖角化病(epidermolytic palmoplantar keratoderma, EPPK)是一組以掌跖部位角化過度為特點的常染色體顯性遺傳病。該病臨床表現為掌跖部位彌漫性斑塊狀角質變厚，皮損表面光滑、色黃，呈蠟樣改變，邊緣清晰多呈紅色。

1992年，Reis等[1]對1個EPPK大家系進行連鎖遺傳分析，將EPPK的致病基因定位于17q12-q21。而KRT9基因特異性表達于掌跖部位的表皮，被高度懷疑是EPPK的致病基因[2]。繼而在1994年，Reis等[3]報道了第一例存在KRT9基因突變的EPPK病例，至此，該病分子遺傳學機制日臻清晰。

截至當前，中英文文獻中報道的EPPK突變位點已有30個，其中3個為無義突變，其余27個會改變蛋白質一級結構[4]。為了解本例患者的致病突變，運用PCR、一代測序技術檢測該患者KRT9基因。

1 材料與方法

1.1 研究對象 先證者，男，20歲。父母非近親婚配。出生后掌跖部位皮膚即粗糙增厚，可見彌漫性堅硬黃色斑塊，帶有光澤呈蠟樣外觀；兩側手掌及兩側跖部角化程度相近，可見明顯皴裂。皮損邊界清晰，呈淡紅色(圖1a，1b)。身體其他部位皮膚均正常，未見魚鱗病樣改變，皮膚附屬器結構如甲、毛發等均正常。該家系共4代，所有患者均在出生1年內發病。

對先證者行皮膚活體組織病理檢查示：表皮角化過度，顆粒層增厚，顆粒層及棘層內部可見較多裂隙，裂隙內可見大量淡染物質，可見表皮細胞松解。

1.2 標本收集 向患者家系中所有患者充分闡明本研究目的及意義，獲取知情同意后分別采集家系中患者II1、II3、III4、III6、IV1、IV3外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝，-80℃低溫保存。家系中I1由于年長體弱未能來院采血。招募100名正常志愿者(入選條件：年齡不限，性別不限，非孕期，無系統性疾病)，同時采集患者家系中所有正常人外周血2 mL作為對照。家系血樣按照系譜圖(圖1c)編號，正常對照的血樣編號后在相同條件下貯存。

1.3 DNA提取 患者及正常人凍存血樣標本置于室溫完全熔化后，用全血基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技)提取基因組DNA備用，-20℃凍存。

1.4 PCR擴增外顯子 采用Primer 3.0軟件設計KRT9基因8個外顯子的上下游引物。其中，1號外顯子上游引物為5’-GGTGGTGGTTCTGGAGGTG-3’；下游引物為5’-TCCCTGGCTATTATCTGAGCTT-3’。擴增的各目標片段PCR產物長度約為400 bp。采用20 μL PCR反應體系，其中PCR mix 10 μL，DEPC H2O 5 μL，上下游引物各1.5 μL，DNA模板2 μL。PCR擴增條件為：95℃預變性，5 min；35個擴增循環，每個循環由變性(94℃，30 s)、復性(56℃，30 s)、延伸(72℃，60 s)組成；最后72℃充分延伸5 min，4℃保存。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳了解產物情況。

1.5 DNA序列測定與分析 PCR擴增產物純化后，由ABI 3730XL型全自動熒光DNA測序儀(Applied Biosystems)測序。將測序結果與NCBI GeneBank數據庫中人類KRT9基因進行比對，并分析單核苷酸多態性以及可能的致病突變。

1.6 生物信息學分析 運用PredictProtein(https://www.predictprotein.org)對野生型及突變型KRT9蛋白的二級結構進行預測、比較，并重點運用PredcitProtein中COILS子程序分析基因突變對于卷曲螺旋的具體影響。同時對野生型KRT9蛋白進行功能注釋、點突變預測以及基因本體(gene-ontology, GO)分析。運用SwissModel軟件(https://www.swissmodel.expasy.org)對野生型及突變型KRT9蛋白的三級結構、四級結構進行預測、比較。

2 結果

2.1 PCR產物測序結果 本研究檢測的患者基因組DNA經PCR、測序以及后期分析，所有患者的1號外顯子均可檢測到一處錯義突變c.487C>T(圖1d)，導致轉錄翻譯的蛋白質163位精氨酸突變為色氨酸(p.163R>W)。100名正常對照組以及該患者家系中正常人基因檢測均未見此錯義突變。家系中患者其余外顯子及內含子經比對未見突變。

查閱NCBI_SNP數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)可排除該突變為人種特異性SNP，UniProt數據庫(http://www.uniprot.org/uniprot/P35527)提示該位點為熱點突變。

1a, 1b 先證者手掌及跖部皮損，增厚伴皴裂，色黃，呈蠟樣光澤； 1c 家系圖； 1d 家系患者基因測序結果，箭頭所指為c.487C>T.

圖1 先證者臨床表現、家系圖以及基因測序結果

2.2 生物信息學分析結果 野生型與突變型(p.163R>W)的KRT9蛋白的二級結構構型均為混合型，即無規則卷曲(irregular loops)占到全序列二級結構的50%以上，且α螺旋或β折疊均未占到45%以上。兩者的α螺旋構成比相同，均為44.46%；然而突變型的β折疊構成比高達7.38%，遠高于野生型的4.33%。

進一步分析野生型與突變型兩者在各位點的構型情況，通過與已知的平行雙股卷曲螺旋進行相似度分析，突變型卷曲螺旋片段長度縮短，突變位點的局部二級結構發生改變，片段前后的無規則卷曲片段長度對應增加，結構亦發生改變。

分析野生型及突變型的特殊二級結構以及理化性質，兩者除溶解性發生改變外，二硫鍵的個數與分布、核仁組織區(nucleolar organizing regions, NORS)結構域位置、蛋白質等電點、跨膜位點及跨膜片段長度等均無明顯差異。

SwissModel構建KRT9野生型及突變型的三維結構模型，兩者的三級結構、四級結構模型相同，均在KRT9第222～456位氨基酸殘基與已有數據庫中KRT10最優匹配，所得模型空間構象見圖2。模型的全局模型質量評價指數GMQE 0.12，定型模型能量分析 QMEAN-5.54。

圖2 SwissModel預測的KRT9蛋白的空間構象

對KRT9進行功能注釋以更深入了解功能層面的改變。運用PredictProtein軟件點突變效應模塊得到熱圖(圖3)，直觀表示在氨基酸序列各位點發生任何點突變對于蛋白質整體功能的可能影響。本文DNA測序所得基因突變轉錄翻譯所得的氨基酸理論位點為163位，該位點發生R>W突變的預測評分為79分。

藍色框代表放大展示的熱圖位于蛋白質序列的位置；橫軸代表KRT9蛋白的氨基酸殘基序列，星號指第163位氨基酸殘基；縱軸代表20種氨基酸，箭頭指本文中蛋白質突變產物色氨酸(W)；深綠色(分值<-50)強烈提示該突變對于蛋白質無影響，深紅色(分值>50)強烈提示該突變對于蛋白質結構功能產生影響，白色(-50<分值<50)代表影響較弱；黑色代表該位點未突變；p.163R>W對于蛋白質的正常結構與功能產生強烈影響

圖3 KRT9蛋白點突變熱圖

3 討論

掌跖角化病是一類遺傳性慢性皮膚病，臨床表現多樣，按照組織病理學可以分為較為多見的表皮松解性掌跖角化病(EPPK)以及相對少見的非表皮松解性掌跖角化病(non-epidermolytic palmoplantar keratoderma, NEPPK)。掌跖角化病臨床表現為雙側掌跖部位彌漫性角質增厚，皮損境界清楚，邊界多為淡紅色斑；發病早，多為出生時即有或1歲內發病。部分文獻報道，EPPK可合并非外力作用所致指節墊的發生，具體機制仍不明確[5-7]。

EPPK的發生與KRT9基因及其編碼的角蛋白9有關。KRT9與角蛋白絲的組裝相關，參與掌跖部位皮膚形成并維持掌跖部位的成熟皮膚結構[8]。對KRT9進行基因本體分析(Gene Ontology分析，GO分析)，該蛋白廣泛分布于細胞器、中間絲細胞骨架等各細胞結構，與中間絲形成等細胞組成過程密切相關。

生物信息學分析結果顯示，突變型KRT9蛋白的全局二級結構發生改變，β折疊比例顯著高于野生型；此外，突變位點局部卷曲螺旋片段縮短，兩端無規則卷曲片段長度增加，導致蛋白質局部二級結構改變。

蛋白質二級結構的改變會影響三級乃至四級結構并進而造成功能的改變，本研究運用SwissModel軟件預測KRT9蛋白及其突變型的三級、四級結構，以期直觀了解該突變對于蛋白質最終結構的影響。雖然該軟件算法基于當前最完備、最高效的同源匹配模型構建，但該算法需要根據部分蛋白質已有的空間構象數據庫來匹配預測未知蛋白質或氨基酸，而現階段該數據庫容量有限，因此軟件所建立模型對于發生于非同源匹配區域的突變可能欠敏感，預測結果也可能存在偏頗。隨著日后算法的不斷完善以及對蛋白質空間結構研究的不斷深入，日后運用空間建模了解基因突變對蛋白質的影響將日臻成熟、便利。

就蛋白質理化性質而言，KRT9蛋白p.163R>W造成突變型的溶解度發生改變，而在前文預測到的諸如二硫鍵等在突變型與野生型無明顯差異，提示突變型可能通過未作預測的其他分子間相互作用，諸如氫鍵、鹽鍵或范德華力等對于全局結構造成了影響，下一步可著眼上述分子間作用力，以更好揭示其在蛋白質結構、功能及理化性質中的作用。

功能層面所進行的點突變分析結果可知，p.163R>W得分79，該數值越接近100提示發生在該位點的點突變對于蛋白質的影響越大。Kobayashi曾構建同一位點另一熱點突變p.163R>Q的體外表達載體，皮下注射入無毛非孕期大鼠后會出現EPPK類似的臨床表現，進而驗證p.163R>Q為致病突變[9]；而運用點突變分析所得p.163R>Q評分為59分，低于文中所述突變的評分，高度提示p.163R>W 為致病突變。

遺傳性疾病的熱點突變被廣泛用于產前篩查以提高新生人口質量[10,11]。此外，對于熱點突變的生物信息學分析有助于我們更好地理解熱點突變在疾病發生發展中扮演的角色和作用，對于更加透徹地認識疾病、攻克疾病具有重大意義。

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GenemutationdetectionandbioinformaticalanalysisofKeratin9-geneinonepedigreeofepidermolyticpalmoplantarkeratoderma

TANGZhuangli,WANGTian,XIAOShengxiang,WANGXiaopeng.

TheSecondAffiliatedHospitalofXi'anJiaotongUniversity,Xi'an710004,China

s:XIAOShengxiang,E-mail：xiao_sx@163.com

WANGXiaopeng,E-mail：wangdctor@163.com

Objective: To detect the mutations and perform bioinformatical analysis of KRT9 gene in a pedigree with epidermolytic palmoplantar keratoderma.MethodsGenomic DNA was abstracted from peripheral blood of all patients, normal persons in the pedigree and 100 unrelated healthy controls. All exons of KRT9 gene were amplified by polymerase chain reaction (PCR) and the products were sequenced subsequently. The PCR results were compared with the database. Structural and functional analysis were performed via bioinformatical software.ResultsOne hot-spot missense mutation c.487C>T was identified in Exon 1 of KRT9, which was not detected in normal persons in the pedigree and healthy controls. Bioinformatical analyses indicated the mutation changed the global secondary structure and physicochemical property. Functional annotation revealed a probable negative influence on the biological function of KRT9 protein.ConclusionOne hot-spot mutation is identified, which may play a role in the pathogenesis of epidermolytic palmoplantar keratoderma.

epidermolytic palmoplantar keratoderma; KRT9 gene; gene mutation detection; bioinformatical analysis

(收稿：2017-08-08 修回：2017-08-30)