菊粉酶基因克隆表達與油脂的組分分析

趙春海，王志鵬，池振明

（1.濱州職業學院 生物工程學院，山東 濱州 256603；2.中國水產科學研究院 黃海水產研究所，山東 青島 266071；3.中國海洋大學 海洋生命學院，山東 青島 266000）

菊粉酶基因克隆表達與油脂的組分分析

趙春海1，王志鵬2，池振明3

（1.濱州職業學院 生物工程學院，山東 濱州 256603；2.中國水產科學研究院 黃海水產研究所，山東 青島 266071；3.中國海洋大學 海洋生命學院，山東 青島 266000）

為了實現解脂亞羅威亞酵母（Yarrowia lipolytica）直接利用菊粉進行油脂生產，將外切菊粉酶基因INU1與表達質粒pINA1317連接，在解脂亞羅威亞酵母（Y.lipolytica）ACA-DC尿嘧啶缺陷突變菌株中表達。以尿嘧啶缺陷型篩選作為篩選標記獲得轉化子C37，經過培養菊粉酶酶活達到37.15 U/mL。在2 L發酵罐中，轉化子C37以菊粉為底物進行發酵，油脂產量和細胞干質量分別為49%和14 g/L。脂肪酸分析結果顯示棕櫚酸、⒉脂酸和油酸總和占總脂肪酸的92%以上，其中油酸含量高達59%，表明通過菊粉酶基因在解脂亞羅威亞酵母中的表達，實現了以菊粉為底物一步發酵產單細胞油脂。

解脂亞羅威亞酵母；菊粉酶；單細胞油脂；基因表達

現今環境問題日益嚴重，尤其是大氣污染，因此生物油脂進行柴油的生產備受關注。生物柴油不僅可以降解，而且還可以應用于現存的機車中，產生較少量的有害氣體（如二氧化硫），生物柴油產生的二氧化碳凈排放量僅為傳統化石柴油的22%[1-2]。生物柴油可以通過生物油中的甘油三酯的酯交換反應來生產[3-5]，單細胞油脂來源廣泛，多種微生物（如酵母、細菌、微藻）都能夠積累，單細胞油脂中研究較多的是酵母和霉菌細胞內的油脂，研究表明，酵母和霉菌油脂積累高于其他生物[6]，同時酵母具有生長快、積累油脂含量高、與植物油脂十分相似等特點。微生物油脂（如單細胞油脂）可以通過化學和酶的催化轉化成生物柴油[7]。目前報道多種酵母都能夠積累油脂，如白色隱球酵母（Cryptococcusalbidus）、彎曲隱球菌（Cryptococcuscurvatus）、圓紅冬孢酵母菌（Rhodosporidium toruloides）、膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）等，同時CHUN H Z等[8]研究結果表明，解脂亞羅威亞酵母（Yarrowialipolytica）以葡萄糖、木糖、甘露糖、甘油、水解淀粉以及農副產品殘留物為原料，可發酵產生單細胞油脂，油脂積累可達40%。

目前高昂的制造成本是生物柴油工業化應用的主要障礙，生物柴油高昂的制造成本與原料密切相關，同時也失去市場競爭力[9]。因此用廉價的原料是制造生物柴油從而減低其成本的一個關鍵。為了降低酵母生產油脂的成本，必須尋找能替代葡萄糖、谷物為碳源的生產原料，已有報道采用雪蓮果[10]、纖維素[11]、半纖維素[12]、甘蔗糖液[13]、甘薯[14]、秸稈[15]、生物工業副產物為原料進行單細胞油脂的發酵生產[16-19]。

菊粉（菊糖）作為一種貯藏性碳水化合物存在于多種植物的根和莖中[20]，菊粉可以用于高果糖漿生產，通過微生物發酵生產酒精、油脂，也可以在菊粉酶水解下生產寡菊糖等可再生原料，近來受到越來越多的關注[21-22]。菊粉酶是一種水解酶，它作用于β-2,1糖苷鍵并將菊粉降解小分子果糖與葡萄糖。目前來源于季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）、馬克思克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus），黑曲霉（Aspergillus niger）的菊粉酶基因已經被深入研究并被克隆表達，重組酶被分離、鑒定[21]。

解脂亞羅威亞酵母（Y.lipolytica）ACA-DC是一株油脂酵母，能積累大量單細胞油脂（每克干物質含油脂0.44～0.54 g，干物質達到9～12 g/L）[3-7]。但是解脂亞羅威亞酵母（Y.lipolytica）不含有菊粉酶基因，無法直接利用菊粉進行生長合成油脂，為了簡化生產工藝，使解脂亞羅威亞酵母（Y.lipolytica）ACA-DC直接利用菊粉和含有菊粉的物質來積累油脂，降低油脂生產成本，本研究克隆了馬克思克魯維酵母（K.marxianus）CBS6556中的菊粉酶基因，并且與表達載體pINA1317連接轉化尿嘧啶缺陷型的Y.lipolytica ACA-DC。以期實現一步發酵生產單細胞油脂，拓寬單細胞油脂合成原料來源，簡化發酵工藝，同時為生物柴油的開發奠定油脂基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 培養基

無氨基氮培養基：硫酸銨5g/L，無氨基酵母氮源1.79g/L，葡萄糖10 g/L，共同滅菌，固體培養基加入2.5%瓊脂。

突變株誘變培養基：5-氟乳清酸（5-fluoro whey acid，5-FOA）0.75 g/L，葡萄糖20 g/L，硫酸銨5 g/L，無氨基氮源1.7 g/L，瓊脂25 g/L。

LB液體培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸膏5 g/L，NaCl 5 g/L，pH7.0。

篩選培養基：將冷卻至50℃的LB液體培養基加入終質量濃度為100.0 μg/mL的氨芐青霉素，瓊脂粉2.5%。

發酵培養基：菊糖20g/L，KH2PO40.3g/L，MgSO40.13g/L，NH4Cl 1.3 g/L，酵母粉1.3 g/L，pH6.0。

1.1.2 菌株與載體

pMD18-T、pMD19-T質粒：Takara寶生物工程（大連）有限公司；pINA1317質粒：國際友人Catherine Madzak饋贈，中國海洋大學微生物實驗室保存，質粒結構如圖1所示；菊粉酶基因的pMD18-T質粒（即pMD18-T-INU1）：由本實驗室構建，并保存于中國海洋大學微生物實驗室；解脂亞羅威亞酵母（Yarrowia lipolytica）ACA-DC：希臘學者Dr.Seraphim Papanikolaou贈㈣[3-5]；大腸桿菌（Escherichia coli）：本實驗室保藏。

圖1 pINA1317質粒結構Fig.1 Structure of pINA1317 plasmid

1.1.3 主要試劑

異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-Thiogalactoside，IPTG）（分析純）：北京百奧萊博科技有限公司；5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside，X-gal）（分析純）：美國Amresco公司；聚乙二醇4000-醋酸鋰（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；基因組提取、質粒純化、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增、切膠回收試劑盒：寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設備

Microfuge20高速冷凍離心機：德國Sigma公司；FA2204電子精密天平：上海京孚儀器有限公司；BYSXT-04索氏提取器：上海秉越電子儀器有限公司；Olimpus CX23顯微鏡：上海賴氏電子科技有限公司；UV-2102 C型紫外分光光度計：上海圣科儀器設備有限公司；2720型PCR儀：德國Eppendorf公司；Mastercycler 5333 GC6890A氣相色譜儀：山東博科生物產業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 尿嘧啶缺陷型的誘變篩選

pINA1317質粒的篩選標記為尿嘧啶缺陷型，為了便于快速對轉化子的篩選，方法參照文獻[19]對解脂亞羅威亞酵母（Y.lipolytica）ACA-DC進行尿嘧啶缺陷型誘變篩選。

1.3.2 菊糖酶基因的克隆以及表達載體的構建

將實驗室保存pMD18-T-INU1中的菊粉酶基因通過PCR方法分離[2]，將pINA1317質粒進行SfiI、BamHI雙酶切，通過連接酶將含有SfiI、BamHI的菊粉酶基因連接到經雙酶切后pINA1317中，設計引物增加SfiI、BamHI限制性酶切位點，上下游引物如下：

上游引物：TCAGTTATCAATTACAAGAGAGATGGTGACAGC

下游引物：TCAATGGTGATGGTGGTGATGAAGGTTAAATTGGGTAACGPCR

反應采用50.0 μL體系；PCR反應條件：94℃預變性8 min，94℃變性30 s，51℃退火1.5 min，72℃延伸3 min，30個循環。PCR產物的回收：經鑒定后的菊粉酶基因在紫外燈下切下目標帶，按照基因回收試劑盒的操作步驟進行菊粉酶基因回收。

（1）質粒pMD19-T連接

通過菊粉酶基因體外PCR擴增，在TaqDNA聚合酶作用下，PCR切膠回收產物3′末端A與含有T末端的pMD19-T在20.0 μL反應體系中16℃過夜連接，得到pMD19-T-INU1克隆質粒。

（2）pMD19-T-INU1在大腸桿菌中驗證

將過夜連接的pMD19-T-INU1質粒轉化進入大腸桿菌DH5α感受態細胞中，將轉化后的DH5α細胞培養混合液分別涂布于含有IPTG和X-gal的平板上，37℃培養，觀察菌落顏色。初步篩選白色菌落為陽性菌落，并進一步接種于加氨芐抗生素的篩選培養基中，37℃培養24 h[19]。

（3）pINA1317-INU1油脂酵母表達載體的構建

在25 μL反應體系進行BamHI和SfiI雙酶切質粒，參照文獻 [19]中的方法，進行轉化油脂酵母，獲得還有pINA1317-INU1的油脂酵母。

1.3.3 單細胞油脂組分分析

將發酵的菌體離心干燥研磨成菌粉，采用索氏提取方法進行油脂提取[22]，加入，3 mL15%三氟化硼甲醇溶液混勻，50℃水浴1 h，加入等體積正己烷，加入1/2體積的飽和NaCl溶液，混勻，通過氣相色譜儀進行脂肪酸組分分析[22]。

2 結果與分析

2.1 菊粉酶基因的克隆與驗證

將pMD18-T-INU1中菊粉酶基因PCR擴增，擴增產物結果和基因驗證結果見圖2。

圖2 pMD18-T-INU1中菊粉酶基因PCR擴增產物結果Fig.2 Results of PCR amplification products of inulinase gene in pMD18-T-INU1

由圖2可知，從保存在pMD18-T-INU1中獲得菊粉酶基因用于構建表達載體，為了便于與表達載體pINA1317連接，PCR引物設計加入限制性內切酶SfiI和BamHI對應位點，1⒕道擴增產物電⒕結果大小約為1500bp，回收PCR產物，轉化大腸桿菌DH5α，測序驗證擴增基因的序列，結果見圖3。

圖3 pMD19-T-INU1的PCR擴增產物結果Fig.3 Results of PCR amplification products of pMD19-T-INU1

由圖3可知，1、2⒕道中PCR產物大小約為1 500 bp，與已知菊粉酶基因大小相似，基本判定菊粉酶基因已經被連接到pMD19-T中，為了進一步確定還需進行測序進驗證，測序結果與已知基因比對結果一致，可以用于菊粉酶基因重質粒的構建。

切膠回收pMD19-T-INU1中的菊粉酶基因片段，用限制性內切酶SfiI與BamHI對pINA1317進行雙酶，T4連接酶將帶有粘性末端A的菊粉酶基因與酶切后的pINA1317質粒片段連接，構建表達質粒。將表達質粒轉化DH5α，挑取含有菊粉酶基因的陽性轉化子，提取質粒后進行SfiI與BamHI雙酶切驗證，結果見圖4。

圖4 pINA1317-INU1雙酶切電⒕條帶Fig.4 Double-enzyme cutting electrophoretic bands of pINA1317-INU1

由圖4可知，pINA1317-INU1經雙酶切結果分為上下兩條電⒕帶，上面大片段5300bp，為pINA1317，下面小片段大小為1 500 bp，為菊粉酶基因，菊粉酶基因已經在表達質粒pINA1317-INU1中構建成功，可以進行Y.lipolyticaACA-DC酵母轉化。

2.2 pINA1317-INU1轉化片段制備

用Not I酶切pINA1317-INU1，回收酶切的DNA片段進行電⒕檢測，結果見圖5。

圖5 SfiI和BamHI酶切pINA1317-INU1回收條帶Fig.5 Recovered bands fromSfiI andBamHI digestion of pINA1317-INU1

由圖5可知，大片段是含有菊粉酶基因的DNA序列，小片段是pINA1317質粒片段，小片段約2 210 bp左右，大片段約4 700 bp，由pINA1317質粒圖譜大小和酶切位點可知大片段的是包含INU1基因的待轉化片段，回收線性化大片段，用于尿嘧啶油脂突變株的轉化。

2.3 Y.lipolyticaACA-DC尿嘧啶突變株的篩選

將菌株Y.lipolyticaACA-DC劃線接種到含有尿嘧啶的培養基和不含尿嘧啶的培養基上進行篩選[19]，結果如圖6所示。

圖6 尿嘧啶缺陷型解脂亞羅威亞酵母突變株的篩選結果Fig.6 Screening results of uracil defectiveY.lipolyticawith uracil deficiency

由圖6可知，Y.lipolyticaACA-DC經過誘變篩選，突變株能夠在含有尿嘧啶的培養基上生長，而在不含尿嘧啶的對照培養基中則不能生長，表明獲得尿嘧啶缺陷型的Y.lipolyticaACA-D，可用于菊粉酶基因的表達。

2.4 轉化子篩選[19，22]

采用NotI酶切pINA1317-INU1轉化質粒，電⒕回收純化分離大片段轉化的尿嘧啶突變菌株Y.lipolytica缺陷型，轉化成功的菌株以字母C命名轉化子，對菊粉酶酶活超過25 U/mL以上的4菌株進行命名并保存，結果如表1所示。

表1 轉化子中菊粉酶酶活測定結果Table 1 Determination results of inulinase activity of the transformants

由表1可知，轉化子C37、C95菊粉酶活相對較高，超過30 U/mL，以不含菊粉酶基因的野生菌株為對照，野生型酶活為0，證明菊粉酶基因已經在轉化子中成功表達，其中轉化子C37酶活最高，達到（37.15±0.40）U/mL。

2.5 2 L發酵罐中菌株發酵產單細胞油脂

在2L發酵罐中，轉化子C37生長和產油情況如表2所示。

表2 以菊粉為主要碳源的培養基上菌體生長、油脂產量Table 2 Cells growth and oil yield in the medium with inulin as main carbon source

由表2可知，在2L發酵罐中，以菊粉為主要碳源的培養基上，經過分批發酵80 h，細胞干質量和油脂產量分別為14.12g/L、49.23%。野生型解脂亞羅威亞酵母菌株在甘油和動物油脂為主要營養物質發酵時細胞干質量為9～12g/L[9，22]，油脂產量在44%～54%[22]，生物量和油脂積累量表明轉化子C37與野生型原始菌株相比均有提高，轉化子C37能夠利用來源更為充足的菊粉、菊糖為碳源進行油脂生產。

2.6 油脂的脂肪酸組分測定

收集轉化子C37細胞，105℃干燥恒質量后制備菌粉，通過索氏提取方法進行細胞油脂提取，采用氣相色譜儀分析油脂中脂肪酸的組成[22]，結果如表3所示。

表3 轉化子C37所產油脂中脂肪酸組分分析Table 3 Component analysis of fatty acids in oil produced by transformant C37

由表3可知，棕櫚酸、⒉脂酸和油酸3種脂肪酸總和超過92%以上，菌株C37發酵積累合成的油脂中6種脂肪酸與文獻[22]中報道的油脂酵母的脂肪酸相似。前期研究發現，在膠紅酵母TJY15a在菊Ⅲ的提取物上培養時，棕櫚酸、⒉脂酸和油酸3者含量之和超過87.6%[22]；另外研究還發現膠紅酵母TJY15a在淀粉水解物上生長時，三種脂肪酸超過85.8%，其中油酸占63.5%。本研究結果中油酸產量占59.29%，表明轉化子C37與其他油脂酵母含有的脂肪酸非常相似[23-25]。這意味著轉化子C37產生油脂是一種很好的生物油脂材料。

3 結論

為了將菊粉酶基因克隆到油脂酵母中，實現解脂亞羅威亞酵母（Yarrowia lipolytica）產酶，產油同時進行，本研究通過對解脂亞羅威亞酵母ACA-DC進行基因改造，獲得含有菊粉酶基因的轉化子C37，經過培養，菊粉酶酶活達到37.15U/mL。脂肪酸分析顯示棕櫚酸、亞油酸和油酸占總脂肪酸的92%以上，尤其是油酸含量高達59%，表明通過菊粉酶基因在油脂酵母中的表達，實現了以菊粉為底物一步發酵產單細胞油脂，為綜合開發利用單細胞油脂提供了新的途徑，也為油脂中多種脂肪酸的開發和利用奠定了原料基礎。

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Cloning and expression of inulinase gene and analysis of oil components

ZHAO Chunhai1,WANG Zhipeng2,CHI Zhenming3
（1.College of Bioscience Engineering,Binzhou Polytechnic,Binzhou 256603,China;2.Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Qingdao 266071,China;3.College of Marine Life Sciences,Ocean University of China,Qingdao 266000,China）

In order to realize oil production directly from inulin byYarrowia lipolytica,exoinulinase geneINU1was connected with expression plasmid pINA1317 and expressed in mutant strainY.lipolyticaACA-DC with uracil deficiency.With uracil deficiency as selection marker,transformant C37 was obtained and the inulase activity was up to 37.15 U/ml by culture.In 2 L fermenter,transformant C37 was fermented with inulin as substrate,the oil yield and cell dry mass were 49%and 14 g/L,respectively.The results of fatty acids analysis showed that the total contents of palmitic acid,stearic acid and oleic acid were more than 92%of total fatty acids,and the oleic acid content was up to 59%,which indicated that the one-step fermentation was realized to produce single cell oil with inulin through the expression of the inulinase gene inY.lipolytica.

Yarrowia lipolytica;inulinase;single cell oil;gene expression

Q815

0254-5071（2017）12-0115-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.024

2017-06-15

山東省中青年科學家科研獎勵基金（博士基金：BS2012SW001）；山東省高等學?？萍加媱濏椖浚↗14LE58，J17KA122）；國家自然科學基金（31500032）

趙春海（1979-），男，副教授，博士，研究方向為微生物發酵。