miR-451a調控BAP31誘導結直腸癌細胞凋亡

許可 韓彬 柏楊 周黎明

(四川大學華西基礎醫學與法醫學院藥理學教研室，四川 成都 610041)

論著

miR-451a調控BAP31誘導結直腸癌細胞凋亡

許可 韓彬 柏楊 周黎明△

(四川大學華西基礎醫學與法醫學院藥理學教研室，四川 成都 610041)

目的：探討miR-451a及靶蛋白BAP31在結直腸癌中的作用。方法體外培養HCT116、SW620、SW480、DLD細胞，以Real-time PCR法檢測結直腸癌細胞系中miR-451a和BAP31的相對表達量；通過建立miR-451a不同表達情況的結直腸癌細胞HCT116模型，應用抑制消減雜交方法建立抑制消減文庫，從中篩選miR-451a的調控蛋白，并通過螢光素酶報告基因檢測miR-451a的直接調控靶基因；采用MTT法、流式細胞術以及Hoechst染色法評價miR-451a調控的靶蛋白BAP31對結直腸細胞凋亡的調節作用。結果在抑制雜交消減文庫中得到了miR-451a可能調控的相關基因，其中在正向文庫中得到BAP31、EEF1A1和CDC20等7個基因，在反向文庫中得到DKK1和PSME1等4個基因。在HCT116、HT29、SW480、SW620和DLD結直腸癌細胞中miR-451a的相對表達量是正常結腸上皮細胞NCM460中的0.32、0.44、0.53、0.43和0.73倍，BAP31在DLD、HT29、SW620和HCT116結直腸癌細胞中的表達量是正常結腸上皮細胞NCM460中的1.85、2.84、2.37和3.71倍。雙螢光素酶報告基因實驗證明，miR-451a可作用于與BAP31開放閱讀框上游177的位點，通過miR-451a作用使海腎熒光素酶的活性降低80.3%。在HCT116細胞和SW620細胞中過表達miR-451a后72h抑制率分別為39.50%和39.50%；沉默BAP31后72 h抑制率分別為45.32%和53.56%。過表達miR-451a 48 h后HCT116凋亡增加13.57%，SW620細胞凋亡率增加13.2%；沉默BAP31 48 h后HCT116細胞凋亡增加5.62%，SW620細胞凋亡率增加8.68%。結論miR-451a在結直腸癌細胞中能夠直接通過調控BAP31誘導細胞的凋亡從而抑制細胞的增殖。

結直腸癌；miR-451a；BAP31；凋亡

結直腸癌是世界上發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。據WHO報道截止2012年，結直腸癌的發病率以2%的速度迅速上升，全球新診斷結直腸癌患病人數為136萬例，占發病率第3位，而死亡人數也達69.4萬例，占腫瘤患者死亡率的第二位[1]。而隨著生活水平的提高和飲食結構的改變，中國城市結腸癌的發病率更是遠遠超過國際水平成為第四大常見惡性腫瘤，僅次于肺癌、胃癌和肝癌，僅2012年新發病例約40萬人[2]。因此，結直腸癌是各國重點防治的惡性腫瘤之一。

MiR-451a定位于人類染色體17q11.2，于2005年被Altuvia等人首次在人腦垂體RNA中發現并命名[3]。大量研究表明，miR-451a表達量在眾多腫瘤，如：慢性髓細胞白血病、膠質瘤細胞、非小細胞肺癌、頭頸部鱗癌、胃癌中均明顯下調[4-8]，而且可以上調多藥耐藥基因的表達從而增加卵巢癌的化療耐藥性[9]。若過表達miR-451a則能顯著降低結腸癌細胞SW480的侵襲能力[10,11]，可見miR-451a在胃腸腫瘤中可能作為一個抑癌因子參與了消化道腫瘤發生、發展過程的調控。

B細胞受體相關蛋白31(B cell receptor associated protein 31，BAP31)是由738個核苷酸編碼246個氨基酸殘基，分子量為28 KD，屬于B細胞受體相關蛋白家族，定位于內質網上，是重要的內質網分子伴侶蛋白，能與轉運調節因子進行信號傳遞[12,13]。研究發現，BAP31在宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、食道癌、肝癌、結直腸癌和肺癌組織中均呈現高表達[14]，然而意義卻并不明確。本研究擬通過抑制消減雜交的方法，研究miR-451a可能調控的下游基因，并以文庫中篩選得到的下游基因BAP31為研究對象，探討其在結直腸癌發生發展中的具體作用。

1 材料與方法

1.1 質粒和菌株

過表達miR-451a慢病毒Lv-miR-451a和空白對照慢病毒Lv-miR-451a-NC由中國漢恒公司構建。pGM-T載體購于北京天根生物公司，轉化用感受態大腸桿菌JM109菌株為實驗室保存菌株，感受態細胞制備由本實驗室自己制備。雙熒光素酶報告載體pSicheck2.0購于北京碧藍橙生物科技公司的。設計miR-451a過表達引物，擴增miR-451a的前體序列，插入載體pcDNA-3.0載體中。設計BAP31沉默的引物和亂序引物Scramble插入載體psilencer-3.0+，引物稀釋成10 mM，并在DNA雜交液中，插入載體pcDNA-3.0載體中，引物如下表。根據http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/在線軟件工具RNAhybrid預測miR-451a可能對BAP31基因的調控位點，設計插入雙熒光素酶載體引物BAP31-(-148)、BAP31-(-177)、BAP31-(666)、BAP31-(3UTR)，見表1。

1.2 細胞培養及轉染

HCT116、SW620、SW480、HT29、DLD結直腸癌細胞株，正常結腸上皮細胞NCM60，以及用于雙熒光素酶報告基因載體轉染的293T細胞均為本實驗室保存。培養時均用含10%胎牛血清，1%青鏈霉素的DEME培養基在5%CO2、37℃細胞培養箱中進行培養。293T細胞培養至聚合度為60%-80%時用于轉染。轉染時采用Lip2000，按照每μgDNA加入2 μL進行細胞轉染。

1.3 RNA提取及反轉錄

細胞總RNA提取采用Trizol方法。向6孔板中每孔加入Trizol試劑500 μl，待細胞全部裂解后，收集裂解液轉入1.5 ml EP管中；組織標本從液氮中取100 mg，向樣品中加入Trizol試劑500 μl，組織勻漿機迅速勻漿后，收集勻漿液至1.5 mlEP 管中，加入Trizol至1 ml，室溫靜置5 min。加入氯仿0.2 ml，充分劇烈振蕩15 s，室溫靜置5 min。4℃、12000 g離心15 min，吸取上層水相，向水相中加入等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10 min，4℃、12000 g離心10 min。移去上清液，加入預冷的75%DEPC水-乙醇1 ml，輕輕震蕩，洗滌沉淀，4℃、7500 g離心5 min。棄上清液，自然風干5-10 min，加入DEPC水30 μl，溶解沉淀。取RNA樣品1 μl通過NanoDrop ND-1000微量分光光度計檢測各RNA樣品的質量。樣品質檢合格后立即用RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase，于42℃反應60 min，75℃滅活5 min，逆轉錄產物放在冰上待用或-20℃保存。逆轉錄引物序列見表2。

1.4 Realtime-PCR

按VazymeAceQqPCR試劑盒說明書，配置PCR反應體系。Realtime-PCR于Bio-Rad CFX96定量PCR儀上進行。最后用2-△△CT公式計算癌組織相對于癌旁組織中的miR-451a和BAP31相對表達量。引物序列見表3。

表1 引物序列

表2 逆轉錄引物

表3 Realtime-PCR引物

1.5 抑制消減文庫建立

采用雙向的SSH來獲取差異表達基因，分別以轉染空白對照慢病毒HCT16 cDNA為Tester，以過表達miR-451a的HCT116的cDNA為Driver，得到正向文庫(Forward-subtracted library，FSL)；再以過表達miR-451a的HCT116的cDNA為Tester，以轉染空白對照慢病毒HCT16的cDNA為Driver得到反向文庫(Reverse-subtracted library，RSL)。采用SMART PCR技術合成雙鏈cDNA。在0.5 mL RNase-Free的Ep管中，采用SMART IIA Oligonucleotide引物，使用SMART Script Reverse Transcriptase (Clontech，10 U·mL-1)，逆轉錄合成第1鏈cDNA，進一步合成ds cDNA。兩組ds cDNA，分別用RsaI酶切，將酶切產物進行兩輪雜交和兩輪PCR，產物經純化并定量后連接到pGM-T載體中，16℃連接過夜。取連接產物5.0 μL加ddH2O 5.0 μL用于轉化E.coliJM109感受態細胞。涂布于含100 μg·mL-1氨芐青霉素的LB平板，37℃培養過夜。挑取陽性克隆接種于2 mL含100 μg·mL-1氨芐青霉素的LB培養基中，37℃培養過夜。將部分陽性克隆送成都擎科公司測序。將序列登錄美國國家生物信息中心網站，用BLAST 軟件將得到的序列在線與GenBank中的序列進行同源性比對。將測序所得的基因序列提交Http://www.omicsbean.com.cn進行GO數據聚類分析，分析結果由網站提供。引物序列見表4。

1.6 組織總蛋白的提取和Western blotting

取組織各標本組織 100 mg放入EP管中，并加入1 ml DNA/RNA/蛋白質提取試劑盒中的GTC裂解液(每500 μL加入β-巰基乙醇10 μL)。用電動勻漿器置于冰上勻漿，至肉眼不見塊狀組織為止，收集經過提DNA、RNA柱子后的液體，轉入10 mLEP管中，加入4倍體積的預冷丙酮。-20℃沉淀過夜。12000 rpm 4℃離心10 min，棄上清，加入1 mL冰乙醇潤洗12000 rpm 4℃離心3 min，加入600 μL蛋白Loading buffer，沸水煮10 min，-80℃儲存備用。取稀釋好的樣品進行 SDS-PAGE電泳(分離膠12%，濃縮膠5%)，轉膜，4℃封閉過夜。一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌后，再與HRP標記的二抗于室溫孵育1 h，ECL顯色，照相。

表4 抑制消減雜交文庫所需引物

1.7 雙熒光素酶報告基因構建

將構建的螢光素酶報告載體pSicheck-BAP31-148, pSicheck-BAP31-177, pSicheck-BAP31-666和pSicheck-BAP31-3UTR。當293T細胞生長至80%聚合度時，按照空白、pCDNA+pSicheck、pCDNA-miR451a+pSicheck、pCDNA-miR451a+pSicheck-148、pCDNA-miR451a+pSicheck-177、pCDNA-miR451a+ pSicheck-666、pCDNA-miR451a+ pSicheck-3UTR、pCDNA +pSicheck-148、pCDNA+pSicheck-177、pCDNA+pSicheck-666、pCDNA + pSicheck-3UTR按照miR-451a兩倍于psicheck載體的量共轉染293T細胞。在48 h后按照Promega 雙螢光素酶報告檢測試劑盒操作，先用PBS洗滌后，加入PLB制成裂解液400 μl。將小量細胞裂解液20 μL和熒光素酶測試試劑II(LARII)100μL混合，螢火蟲熒光素酶的活力立即用熒光照度儀檢測。檢測完后立即加入Stop &GloTM試劑100 μL，淬滅螢火蟲熒光素酶反應，同時激活Renilla熒光素酶反應，并立即檢測Renilla熒光素酶的活力。以熒火蟲熒光發光強度為內參，以pCDNA+pSicheck-NC組為陰性對照，得到其余各組海腎熒光相對發光強度。

1.8 MTT法測細胞增殖能力

收集細胞，接種于96孔板，每孔細胞數5×103，每組設三個復孔。用含10%胎牛血清，1%青鏈霉素的DEME培養基在5%CO2、37℃細胞培養箱中進行培養24 h，待細胞貼壁后，將pcDNA、pcDNA-miR451a、pSilencer-Scr、psilencer-BAP31轉染細胞。轉染0、24、48、72、96、120 h后，將待測孔每孔加入MTT溶液(5 mg·mL-1)20 μL，繼續培養4 h后，棄培養液。每孔加入DMSO150 μL，避光震蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶標儀上于570 nm處檢測各孔吸光值(OD)。繪制對應時間的生長曲線。

1.9 Hoechst染色

HCT16、SW620轉染pcDNA-miR451a、pcDNA-NC、psilencer-BAP31及對照質粒psilencer-Scr。48 h后用4%甲醛固定20 min，適當洗滌去除固定劑。滴加少量Hoechst33342染液。室溫放置3-5 min。吸除Hoechst33342染色液，用PBS洗滌2次，每次3-5 min。封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.10 流式細胞檢測細胞凋亡

用不含EDTA的胰酶消化細胞后，300 g，4℃離心5 min收集細胞。胰酶消化時應注意觀察細胞，當細胞形狀發生變圓時，立即用含有血清的培養基終止消化。用預冷的PBS洗滌細胞兩次，每次洗滌完畢后，均用300 g，4℃離心5 min。收集細胞，加入1×Binding Buffer 100 μL重懸細胞。加入Annexin V-FITC5 μL輕輕混勻，避光在室溫反應10 min，待上機檢測前10 min再加入PI Staining Solution5 μL，隨后加入1×Binding Buffer400 μL，混勻，再用流式細胞儀檢測。

1.11 統計學計量

2 結果

2.1 HCT116、HT29、SW620中miR-451a的表達情況

通過Realtime-PCR檢測常見結直腸癌細胞株HCT16、HT29、SW480、SW620、DLD與對照正常結腸上皮細胞NCM460中miR-451a的表達量，結果表明：與正常結腸上皮細胞NCM460中的miR-451a表達量相比，miR-451a在HCT116、HT29、SW480、SW620和DLD細胞中的相對表達量分別為0.32、0.44、0.53、0.43、0.73倍，均顯著低于正常結腸上皮細胞NCM460中的表達量(P<0.05)；且在這五株細胞中，以HCT116、HT29、SW620中miR-451a的相對表達量最低，見圖1。

圖1 miR-451a在不同結直腸細胞中的相對表達量注：與正常結腸上皮細胞NCM460相比，*P<0.05、**P<0.01。

2.2 穩定轉染過表達miR-451a的HCT116中，miR-451a表達上升

選擇miR-451a相對表達量最低的HCT116作為建庫的細胞株。利用構建的miR-451a過表達慢病毒載體Lv-miR-451a和空白慢病毒載體Lv-miR-451a-NC轉染HCT116細胞，經嘌呤霉素篩選，得到穩定轉染的細胞株HCT116-Lv-miR-451a和HCT116-Lv-miR-451a-NC。通過Realtime-PCR檢測了穩定轉染過后細胞株中miR-451a的相對表達量，結果表明：HCT116-Lv-miR-451a中miR-451a相對表達量是未經處理的HCT116細胞中的2.1倍，而HCT116-Lv-miR-451a-NC中miR-451a相對表達量是未經處理的HCT116細胞中的1.07倍，HCT116- Lv-miR-451a中miR-451a的相對表達量是HCT116-Lv-miR-451a-NC里的1.96倍。HCT116-Lv-miR-451a中miR-451a相對表達量顯著高于HCT116-Lv-miR-451a-NC中的(P<0.01)，見圖2。

圖2 HCT116細胞轉染miR-451a過表達慢病毒載體Lv-miR-451a和空白慢病毒載體Lv-miR-451a-NC后，miR-451a的相對表達量注：與空白慢病毒載體Lv-miR-451a-NC相比，**P<0.01。

2.3 抑制消減文庫的建立

以HCT116-Lv-miR-451a細胞和HCT116-Lv-miR-451a-NC細胞互為Diver和Tester，構建了正向和反向兩個文庫。文庫質量檢測顯示：第二輪消減PCR產物大小在800-1200bp彌散，大小符合建庫要求，見圖3A；通過對保守基因GAPDH的定量分析，在消減聞庫中GAPDH被消減掉8.26倍，證明抑制消減文庫對相同基因的消減效率符合建庫要求，見圖3B。將經純化后的第二輪PCR產物克隆到pGM-T載體中，然后轉化大腸桿菌JM109，兩個文庫中總共獲得1149個陽性克隆，其中正向庫728個，反向庫421個。對文庫中所獲得的陽性克隆隨機挑取120個，其中正向庫75個，反向庫45個進行測序，測序結果顯示在正向庫中我們獲得了：BAP31、 EEF1A1、CDC20、WDR6、TUFM、RPL13和RPL7A這7個基因的EST序列，其中7個BAP31序列占總測序數的9.33%，4個RPL7A序列占總測序數的5.33%，EEF1A1和RPL13各3個分別占總測序數的4.0%，CDC20、WDR6和TUFM各1個，分別占總測序數的1.33%；在反向庫中我們獲得了：DKK1、PSME1、NDUFA3 和GNB2這4個基因的EST序列，其中5個DKK1序列占總測序數的11.11%，3個NDUFA3序列占總測序數的6.67%， EEF1A1和RPL13各1個分別占總測序數的%，PSME1和GNB2各1個，分別占總測序數的2.22%。以上11個基因的EST經序列比對分析與人類基因組中相對應的基因同源性均為100%。

圖3 SSH文庫質量的檢測注：A—正向消減文庫(L1)、反向消減文庫(L2)和Marker(L3)；B—GAPDH的相對表達水平

2.4 生物信息學結果分析

通過對miR-451a所調控的這些基因在生化過程、細胞組成和分子功能等方面的GO分析，得到了正向文庫中所得到的7個基因主要與轉錄延伸(GO:0006414)，蛋白質在內質網上的定位(GO:0070972)，蛋白質的翻譯(GO:0006412)以及polyA RNA 的結合(GO:004482)高度相關；而反向文庫中的4個基因的聚類分析主要與Wnt信號通路的負向調節有關。進一步生物信息學分析，miR-451a所調控的這些基因參與了細胞分子的轉運，細胞信號傳導和細胞的增殖與生長，見圖4。

圖4 GO分析

2.5 BAP31在結直腸癌細胞株中高表達

利用Realtime-PCR和Westerblot檢測在常見結直腸癌HCT16、HT29、SW620、DLD細胞株與對照細胞株正常結腸上皮細胞NCM460中BAP31的表達量。結果顯示：以正常結腸上皮細胞NCM460中的BAP31mRNA表達量為對照，在DLD、HT29、SW620和HCT116細胞中BAP31的表達量相對于正常結腸上皮細胞NCM460中BAP31表達量的1.85、2.84、2.37和3.71倍(P<0.01)，見圖5A。以正常結腸上皮細胞NCM460中的BAP31表達量為對照，在DLD、HT29、SW620和HCT116細胞中BAP31蛋白的表達量是正常結腸上皮細胞NCM460中BAP31表達量的1.97、2.20、3.22、和2.81倍(P<0.01)，見圖5B、C。

圖5 BAP31在不同細胞系中的相對表達量注：A—DLD、HT29、SW620、HCT116和正常結腸上皮細胞NCM460中BAP31mRNA的相對表達量；B—DLD、HT29、SW620、HCT116和正常結腸上皮細胞NCM460中BAP31 蛋白的相對表達量；C—蛋白質灰度值掃描統計；與正常結腸上皮細胞NCM460相比，**P<0.01。

2.6 雙熒光素酶報告基因證明BAP31為miR-451a的靶基因

經過RNAHybrid工具預測后，選擇得分較高的3個位點，分別為BAP31上游177、上游148和開放閱讀框內(Opening reading frame，ORF)666位點，同時也考慮了microRNA常用作用方式的3′-UTR區域來作為miR-451a的作用靶點進行研究，見圖6A、C。將以上位點的序列克隆進psicheck-2.0載體中，檢測載體上螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶的活性。螢光素酶報告基因的結果顯示：與空白對照組相比，在BAP31ORF上游177、148、ORF666和3′-UTR的預測位點，通過miR-451a作用后，海腎熒光素酶的活性分別降低了80.3%、30.1%、44.6%和42.8%。實驗結果表明miR-451a對BAP31的ORF177位點的作用最強能顯著降低海腎熒光素酶的活性(P<0.01)，見圖6B。

圖6 雙熒光素酶報告基因檢測注：A—RNAHybrid預測得分較高的上游177、上游148和開放閱讀框內666位點與成熟miR-451a的結合位點示意圖；B—雙熒光素酶報告載體中所克隆的序列在BAP31基因上的位置示意圖。C—各克隆片段雙熒光素酶報告載體海腎熒光的相對強度。(與pSicheck空載體對照相比，** P <0.01)

2.7 過表達miR-451a，沉默BAP31可抑制結直腸癌細胞的增殖

HCT16、SW620轉染pcDNA-miR451a、pcDNA-NC、psilencer-BAP31及對照質粒psilencer-Scr。結果顯示：轉染過表達miR-451a，沉默BAP31后，HCT116、SW620兩株細胞分別在48 h后出現對細胞增殖的抑制作用，達到72 h時，抑制效果最為明顯。HCT116細胞過表達miR-451a和沉默BAP31基因后，其48 h抑制率分別為：19.75%和28.23%，72 h抑制率分別為：39.50%和45.32%。SW620 細胞過表達miR-451a和沉默BAP31基因后，其48 h抑制率分別為：31.03%和29.25%，72 h抑制率分別為：39.50%和53.56%，見圖7。

圖7 過表達miR-451a和沉默BAP31后細胞活力測定注：A—HCT116細胞過表達miR-451a和沉默BAP31細胞相對活力；B—SW620細胞過表達miR-451a和沉默BAP31細胞相對活力

2.8 過表達miR-451a，沉默BAP31可誘導結直腸癌細胞凋亡的發生

HCT16、SW620轉染過表達miR-451a質粒pcDNA-miR451a、對照質粒pcDNA-NC；psilencer-BAP31及對照質粒psilencer-Scr。通過Hocheast染色及AnnexinV-FITC/PI 雙染色法流式細胞檢測轉染后48 h細胞凋亡情況。Hocheast染色結果表明：過表達miR-451a或沉默BAP31后，核碎裂增多，凋亡明顯增加，見圖8。AnnexinV-FITC/PI 雙染流式細胞檢測結果顯示：過表達miR-451a 后HCT116凋亡增加13.57%，其中早期凋亡增加5.93%，晚期凋亡增加7.64%；沉默BAP31后HCT116凋亡增加5.62%，其中早期凋亡增加1.3%。晚期凋亡增加4.32%；過表達miR-451a后SW620的凋亡增加13.2%，其中早期凋亡增加7.1%。晚期凋亡增加6.1%；沉默BAP31后，SW620的凋亡增加8.68%，其中早期凋亡增加3.5%，晚期凋亡增加5.18%，見圖9。

圖8 Hocheast染色測定細胞凋亡(×100)

圖9 雙染法流式細胞檢測過表達miR-451a和沉默BAP31后HCT116、SW620細胞凋亡情況

3 討論

MiR-451a在慢性髓細胞白血病、膠質瘤細胞、非小細胞肺癌、胃癌、結直腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中低表達，同時在乳腺癌、卵巢癌耐藥細胞株中也低表達，我們進一步在HCT116、HT29、SW480、SW620和DLD這五株結直腸癌細胞中也發現了miR-451a的表達較正常的結腸上皮細胞低，為后續抑制雜交消減文庫建立篩選細胞奠定了實驗基礎。

為進一步研究miR-451a可能調控的基因，我們采用miR-451a相對表達最低的HCT116細胞，在只改變miR-451a表達量的前提下，建立了miR-451a差異表達的模型。首次利用SSH差異表達基因篩選的方法，建立了分別以轉染空白對照慢病毒HCT16 cDNA為Tester，以過表達miR-451a的HCT116的cDNA為Driver，得到正向文庫(FSL)；再以過表達miR-451a的HCT116的cDNA為Tester，以轉染空白對照慢病毒HCT16 cDNA為Driver得到反向文庫(RSL)，在結直腸癌中篩選到了miR-451a表達量改變后差異表達的基因。SSH的方法已在肺癌、食管癌、胃癌等重大疾病的差異表達基因的篩選上得到了成功的應用，它采用兩次消減雜交和兩次PCR，保證了高特異性；通過雜交操作，可以獲得低豐度差異表達基因；使用SMARTerTMPCR cDNA Synthesis合成cDNA，只需2 ng總RNA，這對于微量RNA的富集起到了關鍵的作用。在我們建立的抑制雜交削減正向文庫中我們得到了BAP31, EEF1A1, CDC20, WDR6, TUFM, RPL13 和 RPL7A這7個基因，在反向庫中我們獲得了DKK1, PSME1, NDUFA3 和GNB2這4個基因。這說明在結直腸癌中當我們上調miR-451a的表達后，BAP31, EEF1A1, CDC20, WDR6, TUFM, RPL13 和 RPL7A這7個基因的表達下降了，而同時DKK1、PSME1, NDUFA3 和GNB2這4個基因的表達卻上調了。這提示我們BAP31, EEF1A1, CDC20, WDR6, TUFM, RPL13 和 RPL7A這7個基因有可能是作為miR-451a的直接靶基因被miR-451a所調控，而DKK1、PSME1, NDUFA3 和GNB2這4個基因有可能是作為miR-451a所調控的通路下游的分子，但仍受到miR-451a的調控，其更清晰的調控通路還需要進一步的研究來證明。

通過對文庫中的基因的GO數據分析，我們發現miR-451a調控的這些基因參與了細胞生化過程、細胞組成和分子功能等方面所起到的作用，主要體現在參與與了轉錄延伸、蛋白質在內質網上的定位、蛋白質的翻譯、以及polyA RNA的結合、負向調劑Wnt信號通路等過程。所以我們認為miR-451a在結直腸癌發生發展過程中的功能很可能是通過調控的這些基因參與了細胞分子的轉運，細胞信號傳導和細胞的增殖與生長。

BAP31在多種惡性腫瘤中高表達，我們進一步在HCT116、HT29、SW620和DLD這四株結直腸癌細胞中也發現了BAP31的表達較正常的結腸上皮細胞高，在后續的實驗中，我們選擇了BAP31表達相對較高的HCT116和SW620作為我們的研究對象。MicroRNA在對靶基因的調控上，經典的調控模式是與其靶基因的3′-UTR端進行結合調控，目前大多數中microRNA靶基因預測的軟件大多基于這樣的思想，在microRNA作用堿基的配對預測上，多采用microRNA5′端作用6-7個堿基嚴格配對的模式進行microRNA靶基因的預測。這種預測模式確實為microRNA所作用的靶基因的研究提供了大量的便利。但是隨著對microRNA的研究越來越深入，大量的研究發現，microRNA對于靶基因的作用方式除了經典的3′-UTR的結合外，還有可能在基因的5′-UTR，ORF區域結合并發揮其調控作用[15-17]。這樣多樣的作用方式在為microRNA靶基因預測方面提出了新的挑戰。我們在研究miR-451a能否直接調控BAP31的時候，通過經典的3′-UTR預測方法得到了結果顯示miR-451a對于BAP31的3′-UTR區域的作用并不強烈。但是通過我們SSH文庫中所得到miR-451a表達下調后BAP31的表達升高，在結直腸癌細胞中發現miR-451a的表達量較正常結腸上皮細胞NCM460表達下降，而BAP31表達較正常結腸上皮細胞NCM460中表達升高，以及在結直腸癌細胞中過表達miR-451a后BAP31的表達量下降了這些結果，我們還是想驗證一下miR-451a是否能直接作用于BAP31。雙熒光素酶結果讓我們感到驚奇，miR-451a對BAP31的5‘-UTR區域序列產生較強的螢光素酶抑制作用，也就是說miR-451a可能是直接作用于BAP31的5′-UTR而發揮調控BAP31的作用的，這也證實了BAP31是miR-451a的直接作用靶基因。進一步研究了miR-451a是如何通過調控BAP31在結直腸癌中發揮作用的。通過我們的研究發現，過表達miR-451a或沉默BAP31 都能顯著抑制結直腸癌細胞的增殖。進一步的研究我們發現，過表達miR-451a或沉默BAP31能夠引起結直腸癌細胞的凋亡增加，甚至在HCT116細胞中，當過表達miR-451a或沉默BAP31時還能使部分細胞直接壞死。從這點看BAP31也有可能作為以后腫瘤治療中的一個新靶點。

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MiR-451aregulatedBAP31incolorectalcancercellsinducedapoptosis

Xu Ke, Han Bing, Bo Yang, Zhou Li-ming△

(Department of Pharmacology, West China School of Basic Medical Sciences & Forensic Medicine,Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041)

Objective： To investigate the role of miR-451a and its target gene BAP31 in colorectal cancer cell lines.MethodsThe relative expression of miR-451a and BAP31 in colorectal cancer cell lines was detected by real-time PCR in HCT116, SW620, SW480 and DLD cells. The inhibitory subtractive library of colorectal cancer cell line miR-451a was established by suppressing subtractive hybridization method by using the different expressing of miR-451a HCT116 model. The BAP31 protein was selected as the study object of miR-451a.Luciferase reporter gene was used to determine whether BAP31 is directly regulated target genes of miR-451a by testing luciferase relative activity.The proliferation of colorectal cancer cells was evaluated by MTT assay. The apoptosis inducted by miR-451a regulated BAP31 was evaluated by flow cytometry and Hoechst staining.ResultsThe genes related to the possible regulation of miR-451a were obtained in the suppression subtractive library. Seven genes, such as BAP31, EEF1A1 and CDC20, were obtained in the positive library. DKK1, PSME1 and other genes were obtained in the reverse library. The relative expression levels of miR-451a in HCT116, HT29, SW480, SW620 and DLD colorectal cancer cells were 0.32, 0.40, 0.53, 0.43 and 0.73 times higher than those in normal colon epithelial cells NCM460. The relative expression of BAP31 in DLD, HT29, SW620 and HCT116 in colorectal cancer cells was 1.85, 2.84, 2.37 and 3.71 times higher than that in normal colon epithelial cells NCM460. Double-luciferase reporter gene experiments show that miR-451a can act on the upstream of the BAP31 open reading frame at 177 site, and the activity of renilla luciferase is reduced by 80.3%. Over-expressed miR-451a in the HCT116 and SW920 cells,the inhibitory rates of were 39.50% and 39.50% at 72 h, respectively; and the inhibitory rates were 58.32% and 53.56% at 72 h after silencing BAP31, respectively. The apoptosis of HCT116 and SW620 cells were increased 13.57% and 13.2% after 48 hours over-expressed miR-451a; the apoptosis of HCT116 and SW620 cells were increased 5.62% and 8.68%after 48 hours of silencing BAP31.ConclusionsMiR-451a can inhibit the proliferation of cells directly by regulating BAP31-induced apoptosis in colorectal cancer cells.

Colorectal cancer; miR-451a; BAP31; Apoptosis

許可，男，講師，主要從事化療藥理研究，Email：xkkls37@hotmai.com。

△通訊作者：周黎明，女，教授，主要從事化療藥理研究，Email：zhou108@163.com。

2017-3-23)