氧化白藜蘆醇在體外抑制人肝癌細胞株增殖和遷移的實驗研究

楊紅專 吳炳火 黃杰

(1.成都市第三人民醫院檢驗科，四川 成都 610031；2.四川大學華西基礎醫學專業2016級本科生，四川 成都 610041)

氧化白藜蘆醇在體外抑制人肝癌細胞株增殖和遷移的實驗研究

楊紅專1吳炳火2黃杰1

(1.成都市第三人民醫院檢驗科，四川 成都 610031；2.四川大學華西基礎醫學專業2016級本科生，四川 成都 610041)

目的：研究氧化白藜蘆醇對體外培養人肝癌細胞QGY-7701、SMMC-7721增殖和遷移能力的影響。方法采用MTT法測定氧化白藜蘆醇抑制肝癌細胞QGY-7701、SMMC-7721生長的IC50；采用Transwell法測定經不同濃度氧化白藜蘆醇(25 μM、50 μM和100 μM)以及白藜蘆醇50 μM與細胞共培養24 h后細胞的遷移率。結果MTT實驗結果顯示，氧化白藜蘆醇抑制QGY-7701和SMMC-7721細胞的IC50值分別為100.37±21.97 μM和74.39±9.30 μM。Transwell實驗結果顯示，經25 μM、50 μM、100 μM氧化白藜蘆醇和白藜蘆醇50 μM處理24 h后，各實驗組細胞遷移率分別是74.96±2.85%、60.26±9.25%、38.58±8.69%和46.80±8.43%。且與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)，氧化白藜蘆醇濃度越高，細胞遷移率越低。結論氧化白藜蘆醇具有抑制體外培養人肝癌細胞QGY-7701、SMMC-7721的細胞增殖作用；可顯著抑制肝癌細胞QGY-7701、SMMC-7721在體外培養條件下的遷移能力，其抑制能力呈濃度依賴性。

氧化白藜蘆醇；肝癌細胞；增殖；遷移

原發性肝癌(Primary carcinoma of liver，PLC，簡稱肝癌)是原發于肝細胞或肝內膽管的惡性腫瘤，是全球發病率最高的癌癥之一，其新增患者人數已超過62.6萬/年，居惡性腫瘤第五位，死亡患者人數接近60萬/年，居腫瘤相關死亡第三位。PLC在我國高發，目前，我國發病患者約占全球的55%；在腫瘤相關死亡中僅次于肺癌，位居第二。腫瘤轉移[1](Metastases)是惡性腫瘤最為顯著的特點之一，也是腫瘤防治中的難點。據相關統計，只有10%腫瘤患者死于原發性腫瘤，另外90%腫瘤患者死于因腫瘤侵襲所致的病情惡化或復發[2]。腫瘤的轉移是指惡性腫瘤細胞脫離其原發部位，在體內通過各種途徑的轉運，到達與原發部位不連續的組織，繼續增殖生長并形成與原發腫瘤同樣病理性質的繼發腫瘤的全過程，是惡性腫瘤危及生命的最主要生物學特性[3]。臨床數據顯示，近30%的患者在明確惡性腫瘤診斷之初，就已經發現有遠處轉移，而另有近30%的患者可能已經存在隱匿的轉移病灶[4]。在對腫瘤的治療上，有學者認為，未來腫瘤治療研究的關鍵應該是能夠抑制或控制腫瘤轉移的治療方案和手段[5]。

自20世紀50年代起，系統性化療法就用于治療肝癌，但其發展與研究多年來始終停滯不前，迄今尚無標準化化療藥物或治療方案[6]。因此，尋找有效的化療藥物是目前研究肝癌藥物化療的熱點。白藜蘆醇(Resveatrol,trans-3,5,4′-trihydroxystilbene，Res)是一類天然來源的二苯乙烯類化合物，存在于虎杖、決明、藜蘆、葡萄、花生、桑椹等多種常見食物及藥用植物中。研究發現白藜蘆醇具有廣泛的藥理活性[7]，包括：心血管保護作用，抗氧化，抗炎，抗腫瘤等。白藜蘆醇作為抗炎藥已在德國上市，又因其具有顯著的癌癥預防及治療作用而備受關注。氧化白藜蘆醇(Oxyresveratrol trans-2,4,3′,5′-tetrahydroxystilbene，Oxyres.)[8]是天然來源的白藜蘆醇羥基衍生物，作為桑枝，菝葜等許多傳統中藥或民族藥的有效成分，研究顯示氧化白藜蘆醇具有諸多藥理活性，近年來也開始受到關注。氧化白藜蘆醇具有強大的抗酪氨酸酶活性，抑制細胞內酪氨酸酶，抑制黑色素的生成；此外，它還具有明顯的抗病毒作用[9]，神經元保護作用，抗氧化，體內外抗炎，抗心血管病，保護肝臟等作用。與具有顯著抗腫瘤活性的白藜蘆醇相比，氧化白藜蘆醇在結構上與白藜蘆醇非常相似。那么，氧化白藜蘆醇是否也具有類似的潛在的抑制腫瘤活性，于是我們對氧化白藜蘆醇的抑制體外肝腫瘤細胞活性進行了初步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞株：人肝癌細胞株SMMC-7721，人肝癌細胞株QGY-7701，為四川大學華西基礎醫學與法醫學院藥理教研室保存。主要藥品:氧化白藜蘆醇(Oxyres)，純度>98%，由四川大學藥學院王峰鵬教授提供；白藜蘆醇(Res)，純度>99%，成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-14102702。主要試劑與耗材：磷酸鹽緩沖試劑PBS，北京中杉金橋生物技術公司；DMEM高糖培養基、小牛血清、0.25% EDTA胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素：成都哈利生物公司；二甲基亞砜DMSO、結晶紫、甲醇：天津市科密歐化學試劑公司；MTT試劑：美國Amresco公司；BD Transwell小室：美國Corning公司；96孔板：耐思生物科技有限公司。主要儀器：TGL16M型高速低溫離心機，長沙湘智離心儀器有限公司；倒置顯微鏡，德國Olympus公司；細胞培養箱，日本SANYO公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞增殖及IC50的測定

生長曲線采用MTT法進行測定。取對數生長期細胞，消化制成2×104個·ml-1細胞懸液，以每孔2×103個細胞接種于96孔板，細胞貼壁后，更換為含藥物的完全培養基，同時設定溶劑對照組，每個濃度組設3個復孔。繼續培養不同時間后，更換為無血清培養基，避光條件下每孔加入5 mg·ml-1MTT溶液20 μl，37℃細胞培養箱中繼續培養4 h。吸棄培養基，每孔加入DMSO150 μl，置酶標儀中避光振蕩5 min，570 nm測定吸光度值。吸光度(A)值的大小可反映細胞活力或細胞數量。按下列公式計算藥物對細胞增殖的抑制率。抑制率(%)=(1-A藥物組/A對照組)×100%。以時間(h)為橫坐標，各組吸光度值為縱坐標，繪制細胞生長曲線。根據48 h各組藥物抑制率，使用SPSS21.0統計軟件計算藥物半數抑制濃度IC50值。

1.2.2 Transwell小室法測定細胞遷移能力

待細胞生長至80%融合狀態時，倒掉培養基，PBS潤洗3次，更換為無血清DMEM高糖培養基，饑餓培養24 h。細胞用胰酶消化后用無血清培養基重懸，細胞計數后，調整細胞懸液密度，SMMC-7721細胞以每孔1.2×105個，QGY-7701以每孔1.5×105個接種于Transwell小室上室，下室中加入650 μl含有20% FCS的DMEM高糖培養基。藥物處理組中，將藥物用無血清培養基稀釋，加入小室上室，對照組加入等體積空白培養基，繼續培養24 h。取出小室，吸棄上室培養基，用PBS潤濕的棉簽輕輕擦去上室中的未遷移的細胞。小室置于24孔板中，每孔加入10%甲醇500 μl，固定下室細胞5 min，轉移小室至新孔中，每孔加入0.1%結晶紫500 μl，室溫染色30 min。蒸餾水水洗至水無色，倒置于載玻片上，37℃烘干。遷移細胞計數：染色后的Transwell小室放于顯微鏡下，隨機選取五個視野進行觀察拍照和細胞計數。結果：遷移至下室的細胞數量表示細胞的遷移能力。按以下公式計算遷移率：遷移率(%)=(藥物組下室細胞數目/對照組下室遷移數目)×100%。

1.2.3 統計學分析

2 結果

2.1 氧化白藜蘆醇對人肝癌細胞增殖的作用

2.1.1 氧化白藜蘆醇對肝癌細胞株生長曲線的作用

以時間(h)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制細胞生長曲線(如圖1)。從生長曲線可見，隨著氧化白藜蘆醇的濃度增加，其細胞的吸光度越低，說明其活細胞數目越少，隨著時間的延長，其細胞的吸光度越低，活細胞數目越少。說明氧化白藜蘆醇濃度增加抑制細胞生長的作用越強，隨著氧化白藜蘆醇作用時間越長，其抑制細胞生長的作用越強。

圖1 氧化白藜蘆醇對肝癌細胞生長曲線的作用(QGY-7701細胞(上)和SMMC-7721細胞(下))

2.1.2 氧化白藜蘆醇對QGY-7701和SMMC-7721細胞細胞增殖半數抑制濃度IC50值(48 h)

從表1中可見，氧化白藜蘆醇抑制SMMC-7721細胞較QGY-7701更為敏感。

表1 氧化白藜蘆醇對QGY-7701和SMMC-7721細胞細胞增殖半數抑制濃度IC50值

2.2 氧化白藜蘆醇對人肝癌細胞遷移的作用

圖2結果顯示，24 h后對照組細胞向下室遷移明顯，各藥物處理組細胞遷移受到不同程度抑制，且計數后計算細胞遷移率，氧化白藜蘆醇組與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)。表2顯示不同濃度氧化白藜蘆醇和白藜蘆醇對肝癌細胞株，QGY-7701和SMMC-7721的遷移率與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)，氧化白藜蘆醇和白藜蘆醇在50 μM濃度作用基本相當。

圖2 Transwell測定不同濃度氧化白藜蘆醇對QGY-7701和SMMC-7721細胞遷移(上圖QGY-7701細胞，下圖SMMC-7721細胞)

表2 不同濃度氧化白藜蘆醇對QGY-7701和SMMC-7721細胞遷移率(n=3)

注：與對照組比較*P <0.05，**P <0.01。

3 討論

文獻報道[7]，白藜蘆醇對不同腫瘤細胞的遷移能力具有較強的抑制作用，顯示出良好的體內外抑制腫瘤轉移的作用，而氧化白藜蘆醇在體外對腫瘤細胞是否具有遷移抑制作用未知。因此，我們進一步探討了氧化白藜蘆醇對肝癌細胞QGY-7701遷移能力的影響，并與白藜蘆醇進行對比。我們前期研究結果顯示[11]，氧化白藜蘆醇對6種不同類型腫瘤細胞株具有良好的抗增殖活性，包括人白血病細胞K562、人卵巢癌細胞SK-OV-3、人乳腺癌細胞MCF-7、人肺癌細胞A549、人鼻咽癌細胞HNE-1、人結腸癌細胞SW480。氧化白藜蘆醇對這6株細胞體外生長的抑制作用，顯示出其良好的抑制腫瘤細胞體外增殖活性。此外，我們發現氧化白藜蘆醇不僅能抑制小鼠S180肉瘤的生長，它還能抑制小鼠肝癌H22移植實體瘤的腫瘤生長[12]，抑瘤機制可能與誘導腫瘤細胞凋亡有關。另外我們還發現，氧化白藜蘆醇具有體內抑制H22肝癌實驗性肺轉移的作用，氧化白藜蘆醇均能減少小鼠肺部轉移結節的數量(數據未發表)。這些數據均提示氧化白藜蘆醇可能具有抑制腫瘤細胞生長和轉移的作用，對于氧化白藜蘆醇進一步體內外抗腫瘤作用研究，將為開發其藥用價值奠定一定的實驗基礎。

1 Valastyan S, Weinberg R. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms[J]. Cell, 2011, 147(2): 275-292.

2 郝希山. 腫瘤學[M]. 人民衛生出版社, 2010, 119-120.

3 任為,李婧,熊堯,等. 小鼠H22肝癌細胞株淋巴結轉移模型的構建[J]. 四川生理科學雜志, 2014, 36(4): 164-166.

4 盧大用. 實驗腫瘤轉移模型及化療研究[J]. 河南醫學研究, 2003, 12(2): 173-178.

6 中國抗癌協會肝癌專業委員會. 原發性肝癌規范化診治專家共識[J]. 臨床腫瘤學雜志, 2009, 14(3): 259-269.

7 袁霜雪,王東旭,伍秋香,等. 白藜蘆醇抑制HCT116結腸癌細胞增殖與Wnt/β-catenin的關系研究[J]. 中國藥理學通報, 2015, 31(4): 537-541.

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9 Chuanasa T, Phromjai J, Lipipun V, et al. Anti-herpes simplex virus (HSV-1) activity of oxyresveratrol derived from Thai medicinal plant: Mechanism of action and therapeutic efficacy on cutaneous HSV-1 infection in mice[J]. Antiviral Res, 2008, 80(1): 62-70.

11 陳夏靜,熊堯,任為,等. 氧化白藜蘆醇體內外抑制小鼠肉瘤S180的作用初步研究[J]. 四川生理科學雜志, 2015, 37(4): 174-176.

12 黃玥,熊堯,周黎明. 氧化白藜蘆醇體內外抑制肝癌細胞增殖的研究[J]. 中藥藥理與臨床, 2015, 31(3): 34-37.

Oxyresveratrolinhibitsproliferationandmigrationofhumanhepatocellularcarcinomacell

Yang Hong-zhuan1, Wu Bing-huo2, Huang Jie1

(1.Clinical Laboratory, Chengdu Third People′s Hospital, Sichuan Chengdu 610031;2.Grade 2016 Undergraduate, West China School of Basic Medical Sciences& Forensic Medicine, Sichuan Universit, Sichuan Chengdu 610041)

Objective： To study the effects of Oxyresveratrol on the proliferation and migration of human hepatocellular carcinoma cells: QGY-7701 and SMMC-7721.MethodsProliferation and growth rate curves have been investigated using MTT; migration rates of the cells have been measured with Transwell assay.ResultsMTT tests showed that the cells in the experimental group with the different concentrations of Oxyresveratrol have been significantly inhibited compared with control group. Transwell experiments showed that migration rates of cells in different concentrations of Oxyresveratrol have been significantly decreased compared with the control group.ConclusionProliferation and migration rates of human hepatocellular carcinoma cells QGY-7701 and SMMC-7721 can be inhibited by Oxyresveratrol.

Oxyresveratrol；human hepatocellular carcinoma cells；proliferation；migration

楊紅專，男，檢驗師，主要從事實驗室檢驗工作，Email：798638162@qq.com。

2017-11-12)