清開靈注射液對老年癡呆小鼠血液、腦組織Aβ含量及神經遞質的影響?

常佩芬，唐蓓蕾，郭 寧，趙紅霞，趙 勇，高永紅，朱海燕△

(1. 北京中醫藥大學東直門醫院心血管內科，北京 100700； 2. 北京中醫藥大學心血管病研究所，北京 100700； 3. 中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700； 4. 國家中醫藥管理局心脈病證益氣活血重點研究室，北京 100700； 5. 北京中醫藥大學中西醫結合氣血研究實驗室，北京 100700)

【實驗研究】

清開靈注射液對老年癡呆小鼠血液、腦組織Aβ含量及神經遞質的影響?

常佩芬1,2，唐蓓蕾1，郭 寧1，趙紅霞3，趙 勇1,2，高永紅4,5，朱海燕1,2△

(1. 北京中醫藥大學東直門醫院心血管內科，北京 100700； 2. 北京中醫藥大學心血管病研究所，北京 100700； 3. 中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700； 4. 國家中醫藥管理局心脈病證益氣活血重點研究室，北京 100700； 5. 北京中醫藥大學中西醫結合氣血研究實驗室，北京 100700)

目的：觀察清開靈注射液對老年癡呆小鼠血液和腦組織中β-淀粉樣蛋白(Aβ)含量以及神經遞質乙酰膽堿(Ach)、一氧化氮(NO)水平的影響，探討清開靈防治老年癡呆的部分作用機制。方法：采用轉基因快速老化癡呆小鼠Sam P8模型，按隨機數字表法分為模型組、清開靈注射液組、陽性藥對照組，以正常老化小鼠Sam R1為正常對照組。實驗組小鼠腹腔注射清開靈注射液1個月后比較各組血清及腦組織中Aβ水平，并檢測腦組織中Ach、NO含量。結果：清開靈可明顯降低癡呆小鼠血液中Aβ含量，增加腦內神經遞質Ach、NO水平。結論：清開靈注射液改善老年癡呆的作用可能與清除血液中Aβ、增加神經遞質Ach、NO水平有關。

清開靈注射液；老年癡呆；β-淀粉樣蛋白；神經遞質

雖然阿爾茨海默病(alzheimer disease，AD)的病因及發病機制尚不完全明確，但淀粉樣蛋白(β-amyloid, Aβ)在其病理發生發展過程中占據中心地位已是不爭的事實。新近的研究提示，AD患者腦中可溶性Aβ可能主要來源于血液[1-2]，可溶性Aβ通過病理狀態下的血腦屏障，在腦內聚集形成有毒物質對神經元造成損傷，同時影響正常神經遞質的產生及代謝，最終導致疾病發生。本研究小組前期實驗證實，清開靈注射液能明顯改善老化癡呆小鼠的學習記憶能力[3]。為此，本實驗采用轉基因老化癡呆小鼠模型，通過檢測小鼠血液及腦組織中Aβ含量和腦實質中神經遞質活性，探究AD的可能發病機制，并觀察清開靈注射液的干預作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2月齡快速老化癡呆雄性小鼠Sam P854只，2月齡正常老化癡呆雄性小鼠Sam R118只(北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號 SCXK(京)2012-0001)。

1.2 藥物及試劑

清開靈注射液(河北神威藥業有限公司，批號13052061)、安理申片(衛材(中國)藥業有限公司，批號130330 A)、小鼠β淀粉樣蛋白1-40酶聯免疫檢測試劑盒(AMEKO，貨號AE91032Mu)、乙酰膽堿(Ach)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號A105-1)、一氧化氮(NO)測試盒(南京建成生物工程研究所，貨號A013-2)。

1.3 儀器設備

電熱恒溫水浴鍋(中國泰斯特，型號HH.W21.420)、全自動酶標儀(Thermo公司，型號MK3)、Olympus BX60型顯微鏡和SPOT-Ⅱ(Diagnostic Instrumens.Inc)圖像采集軟件。

1.4 動物分組及給藥

1.4.1 分組 快速老化癡呆雄性小鼠Sam P854只，按隨機數字表法分為模型組、清開靈組、安理申(陽性藥)組，正常老化雄性小鼠Sam R1為對照組，每組18只。

1.4.2 給藥 清開靈注射液用生理鹽水稀釋成20%的注射液，安理申用純凈水配置成0.07 mg/ml的溶液。清開靈組按3 ml/kg腹腔注射20%的清開靈稀釋液，同時按100 ml/kg灌服純凈水；安理申組按15 ml/kg腹腔注射生理鹽水，同時按0.7 mg/kg灌服安理申；模型組和對照組腹腔注射相同比例的生理鹽水并灌服純凈水，每周連續給藥5 d共4周。

1.5 血液及腦組織中Aβ含量的測定

實驗結束后每組各取6只小鼠采用摘眼球取血，冰盤上剝離取全腦棄嗅球及小腦。離心取血清，腦組織用冰生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分制成10%腦組織勻漿。按說明書采用酶聯免疫吸附法測定各組標本Aβ含量。

1.6 腦組織Ach活性和NO含量測定

每組各取6只小鼠斷頭處死，冰盤上剝離取全腦棄去嗅球及小腦，稱重后加入預冷的生理鹽水，制成10%腦組織勻漿，嚴格按試劑盒要求操作。

1.7 光鏡下海馬CA1區的組織結構變化

每組各取6只小鼠用4%多聚甲醛灌注后取腦，腦組織于4%多聚甲醛固定液固定24 h，經梯度酒精脫水，二甲苯透明后石蠟包埋，行冠狀切片(5 μm)裱于多聚賴氨酸防脫玻片上，避光陰涼處保存。采用伊紅-蘇木素染色法，光鏡下觀察海馬區腦組織。

2 統計學方法

3 結果

3.1 清開靈注射液對癡呆小鼠血液及腦組織中Aβ含量的影響

表1顯示，模型組血液及腦組織中Aβ含量較對照組明顯增加，清開靈注射液可顯著降低血液中Aβ的含量，但對腦組織中Aβ含量的影響相對較小，雖有減少趨勢但差異無統計學意義。

3.2 清開靈注射液對癡呆小鼠腦組織中Ach活性及NO水平的影響

表1顯示，模型組小鼠Ach活性及NO水平均較對照組明顯減少，清開靈注射液可顯著提高癡呆小鼠腦組織中Ach活性，增加NO水平。

表1 清開靈注射液對癡呆小鼠血液及腦組織中Aβ及神經遞質水平的影響

注：與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較:△P<0.05，△△P<0.01

圖1 清開靈注射液對癡呆小鼠海馬CA1區腦組織結構的影響(×40)

3.3 清開靈注射液對癡呆小鼠海馬CA1區腦組織結構的影響

圖1顯示，觀察小鼠海馬CA1 區可見，正常組神經元結構完整，細胞排列整齊，形態正常，分布均勻；模型組大量神經元變性壞死，細胞體積縮小，胞核固縮，染色加深，形狀不規則伴有明顯的嗜神經現象；清開靈組及安理申組部分神經細胞壞死，形狀不規則，核固縮，染色加深，與模型組比較神經元損傷情況明顯減輕。

4 討論

β淀粉樣蛋白在AD的病理發生發展過程中占據中心地位，Aβ如何在大腦中聚集增多是AD研究中的關鍵環節。早期研究認為，AD的發生是由于腦內相關基因突變導致淀粉樣蛋白前體(APP)過度表達或加工異常，致使毒性Aβ產生增加。近期的研究發現，腦中可溶性Aβ可能主要并長期來源于血液[1-2]。在典型的老年癡呆病理過程中，大腦并沒有Aβ產生增加的證據，而更像是Aβ清除能力相對不足[4]。此外，老年癡呆患者的血漿Aβ濃度在易感年齡的某一時期可明顯增加，隨后又回落至正常[5]，因此提出老年癡呆Aβ的血液起源理論[6]。

在前期清開靈注射液干預快速老化癡呆小鼠的研究中發現，清開靈注射液能夠明顯改善老化癡呆小鼠的學習記憶能力[3]。安理申是當前治療輕中度老年癡呆癥的首選藥，在改善老年癡呆癥的認知功能、學習能力及記憶力方面均有明確療效，因此作為此次實驗的陽性對照藥。

本實驗采用轉基因老年癡呆小鼠作為模型組，通過酶聯免疫檢測發現，模型小鼠血液及腦組織中Aβ的含量確實較正常小鼠明顯增加。同時發現，模型小鼠腦組織中Ach及NO濃度顯著減少，其2種神經遞質在一定濃度范圍內與大腦學習記憶能力呈正相關[7]。

通絡治療是王永炎院士“濁毒損傷腦絡”病機理論的核心體現[8]。老年人臟腑功能漸虛，氣血運行失常，生痰生瘀，聚積成濁毒，瘀阻腦絡，神機失用。在AD患者腦內異常聚集的Aβ也可視作內毒聚集的一種表現。清開靈注射液具有清熱解毒、鎮靜安神之功效。采用清開靈注射液干預癡呆小鼠，光鏡下發現該藥能夠明顯改善小鼠海馬CA1 區神經元結構，減少神經細胞的變性壞死，清除AD患者血液中過多的Aβ，增加腦內學習與記憶相關神經遞質Ach及NO含量。本次實驗并未發現清開靈注射液能夠減少腦內Aβ水平，但有這種趨勢。這可能與動物樣本量較少有關，有待進一步驗證。本研究結果為“解毒通絡”治法的擴展應用提供了初步實驗依據，并進一步開拓了AD治療的新思路。

[1] CLIFFORD PM, ZARRABI S, SIU G, et al. Abeta peptides can enter the brain through a defective blood-brain barrier and bind selectively to neurons [J]. Brain Res,2007，1142(1):223-236.

[2] BELL RD, ZLOKOVIC BV. Neurovascular mechanisms and blood-brain barrier disorder in Alzheimer's disease [J]. Acta Neuropathol， 2009,118(1):103-113.

[3] 邱蕾,鄭璐,張瑤,等.清開靈對快速老化癡呆小鼠學習記憶能力的影響及作用機制研究[J].中國中西醫結合雜志, 2010,30(7):738-742.

[4] ZLOKOVIC BV. Clearing amyloid through the blood-brain barrier [J]. J Neurochem， 2004,89(4):807-811.

[5] ZLOKOVIC BV. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders [J]. Neuron， 2008,24,57(2):178-201.

[6] ROY S, RAUK A. Alzheimer’s disease and the ‘ABSENT’ hypothesis: mechanism for amyloid beta endothelial and neuronal toxicity [J]. Med Hypotheses， 2005,65(1):123-137.

[7] GENTILONI SILVERI N, MAZZONE M, PORTALE G, CARBONE L. A general review about the different roles of this innocent radical [J]. Minerva Med， 2001，92(3):167-171.

[8] 李衛紅, 青雪梅. 從絡論治腦病的中藥研發思維探索 [J]. 北京中醫藥大學學報, 2006, 29(5):304-306.

EffectofQingkailingInjectiononAβcontentandNeurotransmitterinBloodandBrainTissueofSenileDementiaMice

CHANG Pei-fen1,2, TANG Bei-lei1, GUO Ning1, ZHAO Hong-xia3, ZHAO Yong1,2, GAO Yong-hong4,5, ZHU Hai-yan1,2△

(1.CardiovascularmedicineofDongzhimenHospital,BUCM,Beijing100700,China; 2.InstituteofCardiovascularDisease,BUCMBeijing100700,China; 3.InstituteofBasicTheoryforChineseMedicine，ChinaAcademyofChineseMedicineScience,Beijing100700,China; 4.KeyLaboratoryofQi-tonifyingandBlood-activatingTherapeuticRulesforCardiovascularDiseases,StateAdministrationofTraditionalChineseMedicine,Beijing100700,China; 5.KeyLaboratoryofChineseInternalMedicine,MinistryofEducation,Beijing100700,China)

Objective:To detect the role of Qingkailing injection on expression of β-amyloid protein(Aβ)、racetylcholine(Ach) and nitric oxide(NO) respectively in mice’s brain and blood.The purpose was to explore the sectional mechanism that Qingkailing injection in the prophylaxis and treatment of Alzheimer’s disease(AD).Methods:Used senescence accelerated mice prone 8(Sam P8)as experiment models,54 transgenic mice were randomly divided into a model group,a therapy group(Qingkailing injection),a positive drug group(Aricept),according to the random number table method.And used Sam R1 as the control group. Therapy group were intraperitoneal injection of Qingkailing injection.The course of treatment of each group was a month.Compared the expression of Aβ in serum and brain tissue,and detected the level of Ach and NO in brain tissue.Results:Qingkailing injection can significantly reduce the expression of Aβ of dementia mice in serum,and increase the levels of Ach and NO in brain tissue.Conclusion:The mechanism of Qingkailing injection improve Alzheimer’s disease is likely related to it clear the Aβ in serum,and increase Ach and NO.

Qingkailing injection; Dementia; β-amyloid protein; Neurotransmitter

國家自然科學基金資助項目(81202686)-解毒通絡法抑制AD血腦屏障轉運Aβ的機制研究

常佩芬(1972-),女，北京人，副主任醫師，醫學博士，從事中醫藥防治心腦血管疾病的臨床與基礎應用。

△通訊作者：朱海燕，Tel:010-84013141， E-mail:zhuhaiyangy@163.com。

R285.5

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1006-3250(2017)11-1552-02

2017-03-18