miRNA-744-5p靶向TGFβ-1抑制胃癌侵襲遷移的機制研究

龔理杰 呂佳 徐繼 錢振淵 葉再元?

miRNA-744-5p靶向TGFβ-1抑制胃癌侵襲遷移的機制研究

龔理杰 呂佳 徐繼 錢振淵 葉再元?

目的 檢測胃癌組織中和人胃癌細胞株中miRNA-744-5p的表達情況，并通過改變胃癌細胞株中miRNA-744-5p的表達，觀察人胃癌細胞株侵襲、遷移能力的變化并探討生物學機制。方法 通過熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測37例胃癌患者的胃癌組織及其配對的癌旁組織中miRNA-744-5p的表達水平，并對胃癌細胞株和正常胃黏膜上皮細胞株中的miRNA-744-5p表達水平進行檢測。在胃癌細胞中分別轉染miRNA-744-5p模擬物（mimic）、抑制物（inhibitor）以上調、下調miRNA-744-5p的表達，通過Transwell試驗檢測其對胃癌細胞侵襲、遷移能力的影響。將通過生物信息學軟件篩選的miRNA-744-5p潛在的靶基因進行雙熒光素酶試驗及Western blot 試驗驗證，并探討其促轉移的分子機制。結果 胃癌組織、胃癌細胞株的miRNA-744-5p表達水平較正常胃黏膜組織、正常胃黏膜上皮細胞株均顯著降低（P＜0.05）。分別上調、下調胃癌細胞中miRNA-744-5p的表達水平，能夠抑制、促進胃癌細胞的侵襲、遷移能力。miRNA-744-5p與TGFβ-1間存在反向調控的關系，TGFβ-1是miRNA-744-5p的靶基因。進一步實驗證明，下調miRNA-744-5p的表達時，TGFβ-1表達上調，而當上調miRNA-744-5p的表達時，TGFβ-1表達下調。結論 在胃癌組織中miRNA-744-5p 的表達水平降低，導致TGFβ-1在胃癌組織中的高表達以促進胃癌細胞的侵襲、遷移。

胃癌 miRNA-744-5p TGFβ-1 侵襲 遷移

Objective To detect the miR-744-5p expression level in gastric cancer（GC）tissue and cells，and to observe the effects of invasion and migration on the gastric cancer cell due to the changes of miRNA expression. To explore the biological function of miR-744-5p in GC.Methods The miR-744-5p expression level was detected in 37 paired GC tissues and normal gastric mucosal tissues by real-time PCR. The expression levels of miR-744-5p in fi ve GC cell lines and the normal gastric mucosal cell（GES-1）were detected similarly. SGC-7901 which with the highest expression level were transected with miR-744-5p inhibitor，and AGS which with the lowest expression level were transected with miR-744-5p mimics.Then they were selected to use for the invasion and migration tests. TGFβ-1 was predicted as a target gene of miR-744-5p by screening of the miRBase Targets，TargetScan Release 5.0 and PicTar databases and identif i ed by the luciferase reporter assay and Western Blot. Results The expression levels of miR-744-5p were lower in GC tissues and cells than in their pair-matched adjacent normal tissues and normal gastric mucosal cell. Up-regulation and down-regulation the expression of miR-744-5p levels could restrain and promote GC cells invasion and migration ability. TGFβ-1 expression was inversely correlated with miR-186-3p expression in GC. TGFβ-1 is one of target gene of miR-744-5p. Conclusions MiR-744-5p is down-regulated in GC tissues and cell lines and associates with the metastasis of GC cell by targeting TGFβ-1.

Gastric cancer MiRNA-744-5p TGFβ-1 Invasion Migration

在我國，胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，居腫瘤死亡第2位［1］。根治性手術聯合化療仍然是胃癌患者的首選治療方案［2］。然而較多胃癌患者確診時已屬中晚期，即使進行根治手術聯合化療其5年生存率仍＜20%［3］。成熟微小RNA（miRNAs）是一段長度在18～25nt的非編碼RNA核苷酸序列，其通過與靶基因的3'UTR區特異性結合，從而影響mRNA轉錄，抑制蛋白質翻譯［4］。研究表明，miRNA的異常表達可能會抑制腫瘤生成，也可能促進腫瘤進展［5］。其中miR-744-5p是新近發現的一個在多種腫瘤發生、發展過程中起重要作用的微小RNA，本文初步探索miR-744-5p在胃癌發生、發展中的作用。

1 材料和方法

1.1 細胞培養 人胃癌細胞株SGC-7901，MKN-45，MKN-28，AGS，BGC-823和正常胃黏膜上皮細胞株GES-1均購自上海中國科學院細胞庫；細胞培養均用含有10%胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）和抗生素（100U/ml鏈霉素和100U/ml青霉素）的1640培養基（美國Hyclon公司），并置于37℃含有5%的培養箱中。貼壁細胞傳代時用0.02% EDTA/0.25%胰蛋白酶消化3～5min。

1.2 臨床標本 37例新鮮胃癌組織標本及配對癌旁組織均取自2014年1月至12月浙江省人民醫院診斷為胃癌并手術切除的患者（年齡41～74歲，男21例，女16例），術前均未行化療，并冷藏于-80℃冰箱。所有患者均知情并簽署同意書，本項目經浙江省人民醫院倫理委員會批準。

1.3 RNA提取，cDNA合成和熒光定量PCR 細胞和新鮮組織標本RNA提取參照Trizol試劑盒使 用 說 明（Thermo Fisher Scientific），cDNA 的合 成 采 用the Superscript Ⅲ cDNA synthesis kit（TaKaRa），miRNA的表達水平檢測采用SYBR green法（TaKaRa）。內參RNU6b的特定正向引物為 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。miRNA-744-5p的特定引物為5'-ACACTCCAGCTGGGT GCGGGGCTAGGGCTAAC-3'。PCR反應體系是：95℃預熱 5min，95℃ 10s，60℃ 10s 、72℃ 10s共 40個循環。結束后分析其熔化曲線。組織樣本及細胞株中miRNA-744-5p相對于內參RNU6B的相對表達水平采用 2-ΔΔCt法進行比較。

1.4 轉染 將胃癌細胞株在六孔板中培養，鋪板濃度2.0×105/每孔，24h后將miR-744-5p表達相對較高的SGC-7901細胞轉染miR-744-5p抑制劑（銳步生物醫藥），將miR-744-5p表達相對較低的AGS細胞轉染miR-744-5p模擬物（銳步生物醫藥），模擬物對照組和抑制劑對照組采取平行設置。轉染采用Lipofectamine 3000試劑盒（Qiagen公司）步驟并按其說明書進行。轉染24 h 后，收集細胞用于后續實驗。

1.5 Transwell實驗 收集轉染24h后的胃癌細胞。Transwell遷移實驗采用 Costar Transwell 試劑盒（康寧公司），侵襲實驗采用含有人工基底膜板的侵襲小室（康寧公司），轉染后的細胞（侵襲實驗用1.5×105個細胞，遷移實驗用8.0×104個細胞）用無血清培養基重懸后被放入Transwell小室上室中，下室中加入30%胚牛血清，遷移實驗在37℃ 5% CO2環境中孵育24h，侵襲實驗在37℃ 5%CO2環境中孵育48h。隨后將Transwell膜用無水酒精固定，上表面非侵入性的細胞用棉簽擦去，然后經蘇木精和伊紅染色，最后在高倍顯微鏡下拍攝穿過膜的細胞數。

1.6 熒光素酶報告實驗和目標基因識別 應用生物信息學軟件預測miRNA-744-5p的靶基因TGFβ-1，確定miRNA-744-5p與靶基因TGFβ-1的作用位點，構建轉染質粒并分以下3組：NC組：共轉染pYr-MirTarget報告質粒、miR-744-5p模擬物的HEK293細胞。TGFβ-1-野生組：共轉染pYr-MirTarget-TGFβ-1-3U報告質粒、miR-744-5p模擬物的HEK293細胞。TGFβ-1-突變組：共轉染pYr-MirTarget-TGFβ-1-3U-D報告質粒、miR-744-5p模擬物的HEK293細胞。螢火蟲熒光素酶反應：在熒光發光計的試管中先后加入100μl的LARII試劑和20μl PLB裂解液，混勻，產生螢火蟲熒光信號，置入檢測儀測量發光值。海參熒光素酶反應：同一樣品中加入100μl Stop&Glo試劑，停止上述反應，同時啟動海參熒光素酶反應，置入檢測儀檢測發光值。對每個轉染組進行標準化熒光素酶活性檢測，所有轉染實驗均設置三個復孔。

1.7 蛋白質印記分析 分別收集轉染后的胃癌細胞，經過水洗、裂解后溶于RIPA緩沖液中，并用蛋白濃度測定試劑盒（Thermo公司）測定蛋白質濃度，檢測采用BCA（bicinchoninic acid）法。將等效量（30～50μg）的蛋白質在10% SDS-PAGE膠中電泳分離，再轉印到PVDF膜上（Millipore公司）。PVDF膜經含5%的脫脂奶粉Tris-緩沖液中封閉2h，再加入TGFβ-1（proteintech公司）一抗，在4℃的環境下振蕩孵育過夜。將孵育過夜的膜用TBST清洗3次后放入含辣根過氧化物酶和1：1000稀釋的二抗中孵育1h，TBST洗滌3次，加入ECL試劑（三一重工），利用化學發光凝膠成像系統（ChemiDoc MP，Bio-rad）檢測Western blot條帶信號。

1.8 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟。檢測miR-744-5p的熒光定量PCR表達水平和熒光素酶相對活性采用（x±s）表示。正態分布結果通過配對樣本t檢驗或單因素方差分析，非正態分布結果且比較多個相關組樣本時，采用Wilcoxon檢驗或Kruskal-Wallis H檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-744-5p在胃癌組織及胃癌細胞株中的表達水平 miRNA-744-5p在胃癌組織中的表達水平明顯低于在正常胃黏膜組織中的表達水平［（0.336±0.028）vs（0.179±0.025），P＜0.05］；miRNA-744-5p在胃癌細胞株 BGC-823、MKN-45、7901、MKN-28、AGS 中的表達水平均低于在正常胃黏膜上皮細胞株GES-1中的表達水平（P＜0.05），且不同胃癌細胞株間兩兩比較，miRNA-744-5p在胃癌細胞株SGC-7901中相對高表達（P＜0.05），而在胃癌細胞株AGS中相對低表達（P＜0.05）。見圖1。

圖1 miRNA-744-5p在胃癌組織及胃癌細胞株中的表達水平

2.2 miRNA-744-5p對胃癌SGC-7901、AGS細胞侵襲、遷移能力的影響 與陰性對照組比較，胃癌SGC-7901細胞轉染miRNA-744 inhibitor 后侵襲、遷移能力均顯著增強；胃癌AGS細胞轉染miRNA-744 mimics 后侵襲、遷移能力均顯著減弱。見圖2。

2.3 miRNA-744-5p靶基因預測與驗證 生物信息學軟件預測到在TGFβ-1的3'-UTR 區有1 個miRNA-744-5p的結合位點。Western blot結果顯示胃癌細胞中上調miRNA-744-5p的表達能夠顯著抑制TGFβ-1的表達（P＜0.05），當抑制miRNA-744-5p的表達時可上調的TGFβ-1（P＜0.05）。雙熒光素酶試驗結果顯示WT 組中的熒光素酶活性明顯低于NC組（P＜0.05）；而MUT組的熒光素酶活值與NC 組比較無統計學差異（P＞0.05）。同時Western blot結果顯示，在胃癌7901細胞中，轉染miRNA-744 inhibitor 下調miRNA-744表達后，TGFβ-1的表達顯著上調（P＜0.05）。與此相反，在胃癌AGS細胞中上調miRNA-744-5p的表達，TGFβ-1的表達顯著下調（P＜0.05）。

3 討論

近年來，越來越多的研究表明，miRNA-744在多種腫瘤的發生、發展中起重要作用，如宮頸癌、鼻咽癌、肝癌和胰腺癌等惡性腫瘤。在宮頸癌中，miRNA-744通過靶向調節Bcl-2影響腫瘤細胞的凋亡能力抑制宮頸癌的增長和進展［6］。在鼻咽癌中，miR-744作為原癌基因通過靶向調控ARHGAP5基因，從而抑制腫瘤細胞的轉移與進展［7］。在肝癌細胞中miR-744的低表達與其肝癌患者的預后密切相關［8］。雖然，miRNA-744在大多數腫瘤中低表達，呈現出抑癌基因的功能，但也有相關研究報道，miRNA-744在腫瘤中呈現高表達，發揮致癌作用，如在胰腺癌中，miRNA-744通過抑制抑SFRP1，GSK3β和TLE3的表達，激活Wnt/β-catenin信號通路，以此促進腫瘤的進展［9］。而miR-744-5p在胃癌中的作用卻鮮有研究。本資料顯示，與在正常胃黏膜組織中相比，miRNA-744-5p在胃癌組織中呈現低表達；下調miRNA-744-5p的表達能夠顯著增強胃癌細胞的侵襲、遷移能力，而上調其表達能夠抑制胃癌細胞的侵襲、遷移能力。提示miRNA-744-5p在胃癌中呈現抑癌基因的功能。通過生物信息數據庫檢索發現TGFβ-1可能為miRNA-744-5p的1個靶基因。TGFβ-1是調節細胞生長和分化的TGF-β超家族中的一員［10］。其參與執行較多細胞功能，包括控制細胞生長、細胞增殖、細胞分化和細胞凋亡［11］。在一些惡性腫瘤的發生發展當中，TGF-β1也起到重要作用。如在乳腺癌中TGFβ-1表現出兩面性，在腫瘤早期可抑制腫瘤生長及影響細胞凋亡，在腫瘤晚期其又轉而成為腫瘤促進因子［12］。在膀胱癌中，通過STMN1基因調節TGFβ-1的表達從而促進膀胱癌侵襲、遷移的能力［13］。研究表明，TGF-β1可誘導上皮間質轉化（EMT）發生，降低腫瘤細胞間的粘附力并增強其侵襲能力［14］。有文獻報道，miR-744-5p可能參與TGFβ-1的轉錄后調節，存在靶向關系［15］。本資料結果顯示相對于陰性對照組，高表達miR-744-5p組的熒光素酶活性明顯降低；且對于TGFβ-1 3'末端有突變的實驗組，miR-744-5p并不能改變其熒光素酶活性。采用免疫印跡試驗進一步證實miR-744-5p與TGFβ-1間存在反向調控的關系，因此作者認為TGFβ-1可能是miR-744-5p下游的靶向調控位點。

綜上所述，miR-744-5p在胃癌組織細胞中表達下調，且高表達miR-744-5p可以抑制胃癌細胞的侵襲遷移能力，而miR-744-5p在胃癌細胞中的抑癌作用可能是通過靶向調控TGFβ-1的表達來實現。

［1］ Chen W,Zheng R,Baade PD,et al. Cancer statistics in China,2015.Ca A Cancer Journal for Clinicians,2016,66(2)： 115.

［2］ De Vitaf. Treatment of gastric cancer. Onkologie,2014,75(5)： 32-9.

［3］ Coccolini F,Cotte E,Glehen O,et al. Intraperitoneal chemotherapy in advanced gastric cancer. Meta-analysis of randomized trials.European Journal of Surgical Oncology,2014,40(1)： 12-26.

［4］ Bartel DP. MicroRNAs： target recognition and regulatory functions. Cell, 2009, 136(2)： 215-33.

［5］ Bartel DP. MicroRNAs： Genomics,biogenesis,mechanism,and function. Cell,2007.

［6］ Chen XF,Liu Y. MicroRNA-744 inhibited cervical cancer growth and progression through apoptosis induction by regulating Bcl-2.Biomedicine & Pharmacotherapy,2016,81(379-87.

［7］ Fang Y,Zhu X,Wang J,et al. MiR-744 functions as a protooncogene in nasopharyngeal carcinoma progression and metastasis via transcriptional control of ARHGAP5. Oncotarget,2015,6(15)： 13164.

［8］ Tan YL,Bai ZG,Zou WL,et al. miR-744 is a potential prognostic marker in patients with hepatocellular carcinoma. Clinics &Research in Hepatology & Gastroenterology,2014,39(3)： 359.

［9］ Zhou W, Li Y, Gou S, et al. MiR-744 increases tumorigenicity of pancreatic cancer by activating Wnt/β-catenin pathway.Oncotarget, 2011,6(35)： 37557-69.

［10］ Kajdaniuk D, Marek B, Borgiel-Marek H, et al. Transforming growth factor β1(TGFβ1)in physiology and pathology.Endokrynologia Polska, 2013,64(5)： 384.

［11］ Fabregat I,Fernando J,Mainez J,et al. TGF-beta signaling in cancer treatment. Current Pharmaceutical Design,2014,20(17)： 2934.

［12］ Zarzynskz JM. Two faces of TGF-beta1 in breast cancer.Mediators of Inflammation,2014,2014(1)： 141747.

［13］ Liu J,Cao J,Zhao X. miR-221 facilitates the TGFbeta1-induced epithelial-mesenchymal transition in human bladder cancer cells by targeting STMN1. BMC Urology,2015,15(1)： 1-9.

［14］ Pang MF,GeorgoddakI AM,Lambut L,et al. TGF-β1-induced EMT promotes targeted migration of breast cancer cells through the lymphatic system by the activation of CCR7/CCL21-mediated chemotaxis. Oncogene,2016,35(6)： 748.

［15］ Martin J, Jenkins RH, Bennagi R, et al. Post-Transcriptional Regulation of Transforming Growth Factor Beta-1 by MicroRNA-744. Plos One, 2011, 6(10)： e25044.

浙江省醫藥衛生科學研究項目（2017KYB018）

310053 浙江中醫藥大學（龔理杰 呂佳）

310014 浙江省人民醫院（徐繼 錢振淵 葉再元）

*通信作者