p66Shc在心力衰竭大鼠血清中的表達及與氧化應激的關系

馬晶 李錦玉?

p66Shc在心力衰竭大鼠血清中的表達及與氧化應激的關系

馬晶 李錦玉?

目的 檢測p66Shc在心力衰竭大鼠血清中的表達并探討其與氧化應激的關系。方法 SD大鼠分為心力衰竭組（HF組）和正常對照組（對照組）。檢測心力衰竭大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）的活力及丙二醛（MDA）的含量；超聲心動圖檢測心室舒張末內徑（LVEDD）、左心室收縮末內徑（LVESD）、左室射血分數（LVEF）；RT-PCR檢測血p66Shc mRNA的表達，并對p66Shc的表達與LVEDD、LVESD、LVEF、MDA、SOD進行相關分析。結果 心力衰竭組SOD、LVEF明顯下降，MDA、p66Shc明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；心力衰竭組p66Shc mRNA的表達量與LVEDD、LVESD、MDA呈正相關（r=0.636、0.620、0.645，P＜0.05），而與LVEF、SOD呈負相關（r=-0.860、-0.650，P＜0.05）。結論 p66Shc與心力衰竭氧化應激密切相關，p66Shc可能參與心力衰竭氧化應激的過程，可為心力衰竭新的治療途徑提供依據。

心力衰竭 氧化應激 p66Shc 超氧化物歧化酶 丙二醛

Objective To investigate the expression of adaptor protein p66shc in rats with heart failure and its relationship with oxidative stress. Methods Rat heart failure model was established by partially banding abdominal aorta.The levels of serum superoxide dismutase（SOD）and malondialdehyde（MDA）activity were examined.The left ventricular end diastolic diameter（LVEDD），left ventricular end systolic diameter（LVESD），left ventricular ejection fraction（LVEF）were measured by routine cardiac ultrasonography.The expression of p66Shc was determined by quantitative real time PCR. Results The levels of SOD and LVEF were signif i cantly lower while the levels of MDA and p66Shc were signif i cantly higher in HF group than that in control group（P＜0.05）.Linear correlation analysis showed that the expression of gene p66Shc was positively related with the level of LVEDD，LVESD and MDA（P＜0.05），but negative related with the level of LVEF and SOD（P＜0.05）.Conclusion P66shc is associated with states of increased oxidative stress. P66shc mRNA levels are increased in HF，which may be involved in the pathogenesis of HF through oxidative stress.

Heart failure，congestive Oxidative stress P66Shc SOD MDA

心力衰竭是臨床常見的心血管病，是各種心臟病發展的終末階段［1］。細胞活性氧的產生是心力衰竭心肌損傷發生的關鍵環節。p66Shc是一種新型長壽調節基因，在調控細胞氧化應激和細胞生命周期凋亡中發揮及其重要的作用。本研究通過測定心力衰竭大鼠和健康大鼠p66Shc、脂類氧化應激標記物丙二醛（MDA）、抗氧化酶類超氧化物歧化酶（SOD）表達水平，評估左心室舒張末內徑（LVEDD）、左心室收縮末內徑（LVESD）、左室射血分數（LVEF），探討p66Shc與MDA、SOD的表達水平改變與心力衰竭的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年SD大鼠（Ⅱ級）40只，雌雄各半，由復旦大學實驗動物學部提供，8周齡，體重（200±20）g。本動物實驗于2016年4月至6月在本院動物實驗中心完成。

1.2 動物分組及模型建立 SD大鼠40只隨機分為正常對照組（對照組）和心力衰竭組（HF組），每組各20只。以腹主動脈縮窄法建立左室壓力負荷心力衰竭模型。以4%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，分離右腎動脈起始部約1.0cm處，27號注射針頭平行放置于腹主動脈上，4號絲線一并結扎，造成腹主動脈狹窄，且腹主動脈直徑縮窄為0.9mm，然后抽出針頭，關腹縫合。經右側頸總動脈插管至左心室，測量左室舒張末壓（LVEDP），LVEDP≥15mmHg為心力衰竭成模的標準。正常對照組鈍性分離后，縫合線僅繞于腹主動脈上，不結扎。

1.3 超聲心動圖檢測 8周后存活的大鼠行超聲心動圖檢測LVEDD、LVESD，求3個心動周期的平均值，并按照Teichholtz公式計算LVEF。

1.4 血清MDA含量、SOD活力檢測 第8周大鼠麻醉后采血，置于離心機中以3500r/min離心20min。取上清液，采用TBA法檢測血清MDA含量，黃嘌呤氧化酶法檢測血清中SOD活力。實驗步驟按試劑盒說明書操作。

1.5 血清p66Shc mRNA表達檢測 第8周采集晨時空腹靜脈血5ml，采用美國sigma公司1077淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，將稀釋的血液緩慢加入到15ml分離液的液面上以2000r/min梯度離心20min，收集并洗滌云霧狀單個核細胞層，加入磷酸緩沖溶液重懸，于-80℃冰箱保存。采用Trizol法提取單核細胞中總RNA。加入1ml Trizol充分溶解細胞，加入0.2ml氯仿，用手劇烈震蕩30s，靜置2min，4℃條件下14000r/min離心20min，取上清液，加入0.5ml異丙醇混勻，-20℃靜置10min，14000r/min 4℃離心20min，棄去上清液，沉淀加入1ml 100%乙醇洗滌1次，4℃，14000r/min離心5min，棄去上清液；沉淀在室溫中放置10min晾干，加入20μl無RNA酶的ddH2O溶解，取1μl用紫外分光光度計測定提取的RNA純度及濃度，A260/A280在1.8～2.0。使用AB公司7500熒光定量PCR儀，按照試劑盒說明書操作，將RNA逆轉錄成cDNA，進行定量PCR檢測p66Shc mRNA表達水平，使用相對定量方法（2—ΔΔCt）計算p66Shc表達量。p66Shc上游引物為5'-GAAGAGCCACCTGACCATC-3'，下游引物為5'-AGGCACCCGAAGAGCATC-3'；β-actin上游引物為5'-CGTGAAAAGACCCAGATCA-3'，下游引物為5'-CACAGCCTGGATGGCTACGT-3'。反應條件：95℃ 30s；95℃ 5s；60℃ 34s，40個循環。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。正態分布計量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，相關性采用線性相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠心臟超聲及血清各指標比較 見表1。

表1 兩組心臟超聲、血清MDA含量等指標比較（x±s）

2.2 HF組p66Shc mRNA與LVEDD、LVESD、LVEF、MDA、SOD的相關性分析 相關分析顯示，p66Shc mRNA與LVEDD、LVESD、MDA呈正相關（r=0.636、0.620、0.645，P＜0.05），而 與 LVEF、SOD 呈負相 關（r=-0.860、-0.650，P＜0.05）。

3 討論

心力衰竭是多種心血管疾病的共同結局，是心臟病患者死亡的主要原因。氧化應激是指機體或細胞內氧自由基的消長失衡，引起活性氧在體內蓄積的一種狀態，且超出機體對于氧化物的清除能力，因而對機體的組織器官造成損失的過程［2］。氧化應激是心血管疾病的重要特征之一。SOD和MDA顯示組織的脂質過氧化程度。心力衰竭時，神經內分泌系統的激活，增加內皮細胞活性氧的產生，減少抗氧化物質的表達，激活氧化應激系統，參與心力衰竭的發生、發展過程。本資料結果顯示，HF組SOD明顯下降，MDA明顯升高，提示氧化應激參與心力衰竭的發生過程。

p66Shc是調控細胞氧化應激和細胞生命周期凋亡的關鍵蛋白，是線粒體活性氧產生的關鍵調節蛋白。自1999年首次報道p66Shc基因敲除的小鼠壽命、細胞活性氧及其誘導的凋亡明顯下降后，國內外學者對p66Shc 功能進行大量研究［3］。Kumar 等［4］研究顯示，p66Shc可調控糖尿病誘導的血管氧化應激和內皮功能障礙。p66Shc基因敲除的小鼠缺血預處理后無心肌梗死面積的減少。抑制p66Shc介導的線粒體凋亡可減少大鼠腸缺血再灌注損傷［5］。本資料中，HF組p66Shc明顯高于對照組，且p66Shc與LVEDD、LVESD呈正相關，而與LVEF呈負相關，提示p66Shc與心力衰竭的發生發展密切相關。

p66Shc由廣泛表達于多種組織細胞中的Shc A基因編碼，分為p46Shc、p52Shc和p66Shc3種亞型。而p66Shc與p46Shc、p52Shc區別在于其N末端具有獨特的CH2結構域，該結構域Ser36位點經PKC-β磷酸化激活后，再經異構化，去磷酸化過程，轉移至線粒體內，發揮促進活性氧產生的作用［6］。Derungs等［7］研究發現，p66Shc在阿爾茨海默病的線粒體功能障礙和體內氧化損傷中發揮作用，p66Shc消融可能是針對阿爾茨海默病認知障礙的新型治療方法。急性冠狀動脈綜合征患者血單個核細胞p66Shc水平比穩定性冠心病和正常對照明顯升高，且氧化應激也增強，提示p66Shc介導的活性氧可能與斑塊破裂相關。本資料HF組p66Shc的表達量與MDA水平呈正相關，與SOD呈負相關，提示p66Shc的表達水平與心力衰竭氧化應激密切相關，p66Shc可能參與心力衰竭氧化應激的過程。

［1］ 張開坤,吳世良.比索洛爾和美托洛爾治療慢性心力衰竭的療效觀察. 浙江臨床醫學,2017,19(4)：680-682.

［2］ 馮學問,林海洋,仇晨峰.氧化應激水平與2型糖尿病眼肌麻痹關系的初步研究. 浙江臨床醫學,2015,17(2)：190-192.

［3］ 李聲娜,張新林,黃為. p66Shc與心血管疾病. 中華心血管病雜志,2014,42(11)：977-980.

［4］ Kumar S,Kim YR,Vikram A,et al. Sirtuin1-regulated lysine acetylation of p66Shc governs diabetes-induced vascular oxidative stress and endothelial dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2017, 114(7)：1714-1719.

［5］ Feng D,Yao J,Wang G,et al. Inhibition of p66Shc-mediated mitochondrial apoptosis via targeting prolyl-isomerase Pin1 attenuates intestinal ischemia/reperfusion injury in rats. Clinical Science, 2017,131(8)：759-773.

［6］ Edwards NA,Watson AJ,Betts DH,et al. P66Shc,a key regulator of metabolism and mitochondrial ROS production,is dysregulated by mouse embryo culture. Mol Hum Reprod,2016,22(9)：634-647.

［7］ Derungs R,Camici GG,Spescha RD,et al. Genetic ablation of the p66Shc adaptor protein reverses cognitive deficits and improves

上海市浦東新區衛生科技項目（PW2015B-17）

201399 上海市浦東醫院

*通信作者