重慶地區(qū)豬流行性腹瀉病毒M基因的序列分析

祁寒松，吳 鵬，趙光偉，楊曉偉

(西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物疾病快速診斷中心，重慶 榮昌 402460)

重慶地區(qū)豬流行性腹瀉病毒M基因的序列分析

祁寒松，吳 鵬，趙光偉，楊曉偉*

(西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物疾病快速診斷中心，重慶 榮昌 402460)

【目的】本文研究了重慶地區(qū)豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV)M基因序列的特征。【方法】2015年期間采集了來自重慶地區(qū)3家規(guī)模豬場的病料，采用RT-PCR的方法對PEDV的M基因進(jìn)行了擴(kuò)增，測序后進(jìn)行了分析，并與中國其他省份、美國、韓國的PEDV毒株進(jìn)行同源性比較，完成了進(jìn)化樹的構(gòu)建。【結(jié)果】3份病料中M基因片段長為426 bp，編碼142個氨基酸。測序表明，3份毒株M基因同源性為98.7 %～99.8 %。與經(jīng)典毒株CV777相比，核酸序列同源性為97.1 %～98.2 %。【結(jié)論】說明PDEV病毒M基因相對保守，可以作為臨床檢測的靶標(biāo)。

豬流行性腹瀉病毒；M基因；序列分析

【研究意義】豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)所引起的一種接觸性腸道傳染病，發(fā)病的豬會出現(xiàn)嘔吐、腹瀉和脫水的癥狀[1]。 PEDV屬于尼多病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Corona-viridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)抗原I群成員，是有囊膜不分節(jié)段的單鏈正股RNA病毒[2]。被感染的病豬小腸上皮細(xì)胞變性，上皮細(xì)胞間的緊密連接消失，絨毛變短，并且感染和復(fù)制的過程較慢，所以其潛伏期較長，斷奶和育肥豬發(fā)病率較高[3-4]。不同生長階段和品系的豬均易感，其中對于哺乳仔豬的危害尤為嚴(yán)重，1 周齡以內(nèi)的哺乳仔豬常在發(fā)病后 2～4 d 死亡，致死率可高達(dá)90.0 % 以上，給當(dāng)前我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[5-6]。【前人研究進(jìn)展】1971年，PED首次在歐洲被發(fā)現(xiàn)，其各項(xiàng)臨床癥狀與傳染性胃腸炎十分相似，發(fā)病率較高，死亡率較低。在1977年被證實(shí)流行于比利時以及英國的傳染病為PED，并在比利時分離得到該病毒[7]。之后，該病迅速傳播到亞洲多個國家。我國自20世紀(jì)80年代以來陸續(xù)有關(guān)于該病的報(bào)道，并且隨后全國26個省市自治區(qū)均有該病發(fā)生。從2010年年底開始，該病在我國的流行區(qū)域面積和流行強(qiáng)度上有不斷擴(kuò)大和增強(qiáng)的趨勢，給我國養(yǎng)豬業(yè)予以重創(chuàng)[8]。豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)兩者均是引起豬腹瀉的常見腸道病毒，二者所引起腹瀉性疾病具有高度接觸傳染性且臨床癥狀、病理變化以及流行病學(xué)特征極為相似，故在組織病理學(xué)和臨床上很難將兩者進(jìn)行區(qū)分開來[9]。由于PEDV、TGEV這2種病毒臨床上所呈現(xiàn)出的相似癥狀，經(jīng)常會發(fā)生混合感染，但是它們沒有共同的抗原性，因此不能交互免疫[10]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者所克隆的幾株P(guān)EDV的M基因，經(jīng)比較分析發(fā)現(xiàn)，M基因極為保守。所以測序和分析當(dāng)前PEDV流行毒株M基因的序列特征可為PEDV診斷檢測方法的建立奠定基礎(chǔ)。【本研究切入點(diǎn)】近年來腹瀉病非常嚴(yán)重，而流行性腹瀉病毒是造成腹瀉的重要病原之一，但由于臨床中腹瀉病的癥狀極為相似，不易與其他病原進(jìn)行區(qū)分，必須借助實(shí)驗(yàn)室診斷方可確診，因此本研究針對流行性腹瀉病毒中較為保守的M基因進(jìn)行分析，為建立基于該基因的檢測或治療方法做鋪墊。【擬解決的關(guān)鍵問題】對重慶地區(qū)流行性腹瀉病毒毒株中M基因進(jìn)行序列分析，與國內(nèi)外流行的毒株比較，分析其同源性和變異性，為進(jìn)一步探究針對M基因建立診斷和治療方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料

本研究測序的PEDV陽性病料樣品由重慶地區(qū)發(fā)生腹瀉的豬場送檢，由西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物疾病快速診斷及防治中心保存。

1.2 試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit)購自寶生物工程(大連)有限公司；DL2000 Marker、pMD19-T Vector、RNase-free水、dNTP等均購自寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖凝膠購自上海生工生物工程有限公司；膠回收試劑盒(TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0)購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

本研究所使用的引物，是參考文獻(xiàn)中根據(jù)GenBank登錄的PEDV M基因保守區(qū)所設(shè)計(jì)[10]，由寶生物工程(大連)有限公司合成，引物序列如下：PEDV-M1：5′-GTCTAACGGTTCTATTCCC-3′;PED V-M2：5′-TTATAGCCCTCTACAAGC-3′。

1.4 樣品處理

取固體組織0.5 g，剪碎，加入1.5 mL生理鹽水，充分研磨，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，10 000 r/min離心2 min，取上清100 μl，用于RNA提取。

1.5 總RNA的提取以及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

取1.4中處理好的100 μl樣品上清液按照TaKaRa RNA提取試劑盒說明書提取PEDV總RNA后，用寶生物工程(大連)有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)體系如下：5×Prime Script Buffer 2 μl，Prime Script RT Enzyme Mix 0.5 μl，Oligo dT Primer 0.5 μl，Random 6 mers 0.5 μl，Total RNA 4 μl，RNase Free dH2O 2.5 μl。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5s，4 ℃保存。

1.6 M基因片段擴(kuò)增、克隆及測序

反應(yīng)體系如下：PremixTaq(TaKaRaTaqVersion) 12.5 μl，cDNA模板 1 μl，上、下游引物各 1 μl，RNase Free ddH2O 10.5 μl。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取5 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，瓊脂糖凝膠濃度為1 %，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。回收目的片段并連接至pMD19-T Vector，轉(zhuǎn)化至DH-5α感受態(tài)細(xì)胞，對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定，將陽性菌株送至上海生工公司進(jìn)行測序。獲得序列利用DNAStar軟件包進(jìn)行分析，并且與NCBI上公布的序列進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 M基因的擴(kuò)增

12份送檢樣中有3份陽性樣品，依次命名為1～3號。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到了相應(yīng)的基因片段，各擴(kuò)增片段大小與預(yù)期相當(dāng)(圖1)。

2.2 M基因序列變化

對3個被檢樣本的M基因片段序列與GenBank中登錄的部分M基因進(jìn)行對比分析(本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增得到M基因片段長為450 bp，編碼150個氨基酸)。1～3號送檢序列與經(jīng)典毒株CV777(GenBank登錄號：AF353511)相比共同變位點(diǎn)有8處(5：T→C；60：G→A；78：C→T；93：C→T；102：C→T；114：C→T；172：T→C；228：T→A)，此外，3號與CV777還有1處變位點(diǎn)(265：G→A)，1號與CV777還有5處變位點(diǎn)(1：T→A；11：T→G；29：C→T；440：T→C；441：C→A)。1～3號送檢序列與四川流行毒株CH-SC2-2012相比，1、2號共同變位點(diǎn)有1處(265：A→G)，此外，1號與CH-SC2-2012還有5處變位點(diǎn)(1：T→A；11：T→G；29：C→T；440：T→C；441：C→A)，3號與其無核酸突變變位點(diǎn)。另外，送檢序列與經(jīng)典毒株CV777相比共同氨基酸突變位點(diǎn)1處(2：V→A)，除此之外，1號與CV777還有4處氨基酸突變位點(diǎn)(1：S→T；4：L→W；10：A→V；147：V→A)，3號與CV777還有1處氨基酸突變位點(diǎn)(89：V→I)。送檢序列與四川流行毒株CH-SC2-2012(GenBank登錄號：JX869044)相比，1、2號共同氨基酸突變位點(diǎn)1處(89：I→V)，除此之外，1號與CH-SC2-2012還有4處氨基酸突變位點(diǎn)(1：S→T；4：L→W；10：A→V；147：V→A)，3號與其無氨基酸突變位點(diǎn)。通過序列同源性比較，所測定的3個毒株M基因序列同源性為98.7 %～99.8 %。與CV777相比，核苷酸同源性為97.1 %～98.2 %。1號與其余28組序列同源性為96 %～98.9 %，2號與其余28組序列同源性為97.1 %～100 %，3號與其余28組序列同源性為96.9 %～100 %，其中2號與加拿大的CAN/Quebec334、哥倫比亞的COL/Cundinamarca、美國的Hawaii/39249和PC177以及中國河南的CH/HNLH、CH/HBXX2的核苷酸同源性為100 %，3號與中國四川的CH-SC2的核苷酸同源性為100 %(圖2)。

M為2000 DNA marker；1～3為擴(kuò)增片段M: DL 2000 marker; 1-3: Fragments of PCR products圖1 M基因的擴(kuò)增Fig.1 Amplification of M gene

3 討 論

近年來豬流行性腹瀉病毒(PEDV)作為引起仔豬腹瀉的主要病原之一，感染此病毒的仔豬主要表現(xiàn)出嘔吐、水樣腹瀉、迅速脫水等癥狀，最后機(jī)體脫水死亡；即使痊愈的仔豬生長也極為緩慢，成為僵豬。哺乳仔豬、育肥豬的發(fā)病率可以高達(dá)100 %，該病對哺乳仔豬的危害表現(xiàn)得最為嚴(yán)重。

圖2 29個毒株M基因核苷酸序列的同源性比較Fig.2 Homology comparison of M gene nucleotide sequences of 29 PEDV strains

1971年英國最先報(bào)道了豬流行性腹瀉(PED)[11]，隨即此病就在歐洲迅速傳播[12]，21世紀(jì)在亞洲各個地區(qū)流行尤其是在中國、泰國和韓國。在我國，此病造成哺乳仔豬死亡率極高，2015年，某規(guī)模化豬場中有50多頭母豬同時出現(xiàn)腹瀉癥狀，超過600頭哺乳仔豬相繼死亡，其中1周齡以內(nèi)發(fā)病的仔豬死亡率高達(dá)95 %。主要臨床表現(xiàn)是消瘦、嘔吐及水樣腹瀉。現(xiàn)場調(diào)查，該場1個月前母豬普免了豬傳染性胃腸炎-流行性腹瀉-輪狀病毒三聯(lián)弱毒疫苗[13]。因此，對于PEDV流行毒株主要抗原基因的分子流行動態(tài)進(jìn)行監(jiān)測，對于預(yù)防和控制PED是有重要意義的。

4 小 結(jié)

本研究通過對PEDV M基因片段的序列分析，發(fā)現(xiàn)其在國內(nèi)外的流行毒株中具有高度保守性(96 %～100 %)，3號被檢毒株可能與四川流行毒株CH-SC2-2012同源。1號毒株可能為變異毒株，但需進(jìn)一步相關(guān)檢測。3株被檢毒株之間的同源性也較高(98.7 %～99.8 %)，這種保守性將有利于我們針對該基因建立PCR診斷方法和研制針對M蛋白的單克隆抗體，以用于臨床上PEDV感染的診斷。PEDV M蛋白是刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)的重要的抗原蛋白之一[14]，而且其氨基酸序列具有高度保守性，對其進(jìn)行序列保守性的分析可為PEDV的診斷和治療試劑研發(fā)提供有力的依據(jù)。

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SequenceAnalysisofMGeneofPorcineEpidemicDiarrheaVirusesinChongqingMunicipality

QI Han-song, WU Peng, ZHAO Guang-wei, YANG Xiao-wei*

(Animal Diseases Rapid Diagnosis Center, Southwest University, Rongchang Campus, Chongqing 402460, China)

【Objective】In this paper, the sequence features ofMgene of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) in Chongqing municipality were studied. 【Method】Three samples from different pig farms in Chongqing during 2014-2015 were collected. RT-PCR method was used for gene amplification,Mgenes of three positive samples were sequenced, their nucleotide sequences by DNA star software were analyzed and compared with strains from other areas, and finally their phylogenetic tree were constructed. 【Result】Mgene in the nucleotide sequences of three positive samples were 426 bp, encoding 142 amino acids. It was found that the nucleotide homology ofMgenes among the three samples was 98.7 %-99.8 %, and compared with classic stain CV777, the homology was between 97.1 % and 98.2 %.【Conclusion】These findings indicated that theMgene is relatively conservative and could be a target of clinical diagnosis.

Porcine epidemic diarrhea virus;Mgene; Sequence analysis

1001-4829(2017)12-2829-04

10.16213/j.cnki.scjas.2017.12.036

2017-01-10

西南大學(xué)教育教學(xué)改革項(xiàng)目(2016JY097,2016JY10 0)；西南大學(xué)中央高校基金基本科研業(yè)務(wù)項(xiàng)目(XDJK2013C057，XDJK2012C100)；西南大學(xué)博士啟動基金(2013Bsr09)

祁寒松(1995-)，男，四川眉山人，主要從事獸醫(yī)微生物研究；*為通訊作者，楊曉偉，碩士，講師，從事獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)教學(xué)科研工作，yangxiaowei396@163.com。

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(責(zé)任編輯陳 虹)