魚類及兩棲動物抗菌肽的研究進(jìn)展

薛林貴 馬萍 尚海 何小燕 陳熙明 劉光繡 陳拓 張威

（1. 蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，蘭州 730070；2. 中國科學(xué)院西北生態(tài)環(huán)境研究院沙漠與沙漠化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070）

魚類及兩棲動物抗菌肽的研究進(jìn)展

薛林貴1，2馬萍1，2尚海1，2何小燕1，2陳熙明2劉光繡2陳拓2張威2

（1. 蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，蘭州 730070；2. 中國科學(xué)院西北生態(tài)環(huán)境研究院沙漠與沙漠化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070）

目前，生物界成功分離750種抗菌肽，其中具有抗腫瘤活性的約占13.1%，源于兩棲動物和魚類分別約占13.3%和9.3%。魚類和兩棲動物抗菌肽均屬最原始脊椎動物，后天免疫系統(tǒng)極為脆弱，大部分依靠鰓、皮膚和腸道呼吸，主要依靠強(qiáng)大的先天固有免疫系統(tǒng)來避免病原菌侵染，因此分布在不同部位的抗菌肽便成了這類低等生物形成廣譜防御第一道防線的重要組成成分。綜述了具有廣譜抗菌活性和免疫調(diào)節(jié)能力的moronecidin、epinecidin-1、paradaxin、misgurin這幾種分布在雜交條紋鱸魚、條帶石斑魚、豹鰨魚和泥鰍的抗菌肽及臭蛙抗菌肽抗菌譜，如moronecidin可殺死所有的革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌；epinecidin-1可有效預(yù)防石斑魚感染嗜鹽弧菌（Vibrio vulnificus）并殺死神經(jīng)壞死病毒；paradaxin 具有抗腫瘤活性；misgurin殺菌能力極強(qiáng)，臭蛙抗菌肽能殺死白色念珠菌，總結(jié)了在畢赤酵母中成功表達(dá)的抗菌肽和源于魚類和兩棲動物中具有抗病毒和抗腫瘤活性的抗菌肽，探討了這幾種抗菌肽應(yīng)用時(shí)存在的問題及解決方案，旨在為綠色、有效的抗菌肽藥物在各個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮巨大潛力提供理論依據(jù)。

抗菌肽；抗菌譜；畢赤酵母

抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）是在外界條件刺激下，動物免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生的一類對外源病原體的致病作用具有免疫活性的多肽物質(zhì)，是動物非特異性免疫防御的重要組成部分［1］。它是廣泛分布于細(xì)菌、植物、軟體動物、兩棲動物、魚類、鳥類和哺乳動物體內(nèi)的小分子多肽，由20-60個(gè)氨基酸殘基組成［2］。自然抗菌肽不僅抗菌，而且還有細(xì)胞凋亡、傷口愈合和免疫調(diào)節(jié)的功能［3］。多黏菌素和短桿菌素是第一個(gè)用于臨床上黏膜感染的陽離子抗菌多肽，具有治療炎癥性皮膚疾病及改善傷口感染愈合的功能。近年來，國內(nèi)外對抗菌肽的研究有了重大突破。例如，從吳郭魚（Oreochromis mossambicus）獲得的抗菌肽tilapia hepcidin 1-5和循環(huán)蝦抗內(nèi)毒素因子（Cyclic shrimp anti-lipopolysaccharide factor，CSALF）能有效殺死石斑魚神經(jīng)壞死病毒（GNNV）［4-5］；從日本鱟血細(xì)胞中提取到的抗菌肽Tachyplesin 1可有效抗貝類病原菌［6］；與現(xiàn)有已確定抗菌肽無結(jié)構(gòu)同源性的水母抗菌肽對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的抑制作用［7］?？咕牡臍⒕鷻C(jī)制為：帶正電的抗菌肽通過作用于細(xì)菌質(zhì)膜磷脂分子上的負(fù)電荷，使膜發(fā)生去極化或形成“孔洞”，進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)作用于DNA或RNA，直接殺死細(xì)菌，從而產(chǎn)生抗菌活性［8］。有研究表明，影響抗菌肽的最關(guān)鍵因素是疏水性和兩親性，而肽鏈長度、電荷數(shù)并不起決定性作用［9］?？咕牡倪@種特殊抑菌機(jī)制很難使致病菌產(chǎn)生抗性和交叉抗性。

魚類的鰓、皮膚和胃腸道是病原微生物侵入的主要途徑，它能夠有效抵制感染的原因在于這些部位含有的豐富抗菌肽。例如，從泥鰍中分離到的misgurin，從冬季比目魚中分離到的pleurocidin和hepcidin，從豹鰨魚中分離到的 paradaxins，從石斑魚中分離到的epinecidin，從雜交條紋鱸魚中分離到的moronecidin和piscidin 4，從八目鰻魚中分離到的hagfish intestinal antimicrobial peptides，從黑鱸魚中分離到的dicentracin，從鯰魚中分離到的parasin和從大西洋八目鰻魚中分離到的hfiap-1等［10-13］。兩棲動物長期暴露的皮膚也含多種抗菌活性物質(zhì)，如從蛙類皮膚腺體上提取到的受交感神經(jīng)控制的多種藥理活性抗菌肽：使血管舒張?jiān)黾油ㄍ感缘乃偌る模╰achykinins）、具有心臟保護(hù)作用的緩激肽（bradykinins）、促甲狀腺激素釋放激素（thyrotropinreleasing hormone、bombesin-like） 和作為免疫系統(tǒng)中重要的調(diào)節(jié)因子阿片樣肽（opioid peptides）［14-17］等。雨蛙（Hylachinensis）產(chǎn)生的雨蛙肽caeruleins，形成兩親性螺旋結(jié)構(gòu)，是一種常見的功能和組成上類似于膽囊收縮素（Cholecystokinin，CCK）的宿主防御肽，能夠刺激胃、膽管和胰腺分泌，降低高血壓和緩解腎絞痛、膽囊痛等［18］。這兩類動物體內(nèi)或體表存在的抗菌肽迅速在先天固有免疫領(lǐng)域成為最新最熱門的研究。本文重點(diǎn)闡述魚類中的鱸魚、石斑魚、豹鰨魚、泥鰍抗菌肽及兩棲動物中的臭蛙抗菌肽的抗菌譜，提出這幾類抗菌肽能在畢赤酵母中成功異源表達(dá)的可能性，探討這幾類抗菌肽的應(yīng)用前景。通過歸納總結(jié)這5類抗菌肽的相關(guān)基礎(chǔ)理論可以為后續(xù)該類研究應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 鱸魚、石斑魚、豹鰨魚、泥鰍和臭蛙抗菌肽的抗菌譜

1.1 鱸魚抗菌肽的抗菌譜

Moronecidin是從雜交條紋鱸魚（Hybrid striped bass）鰓和皮膚中分離得到的含23個(gè)氨基酸殘基，經(jīng)圓二色譜分析結(jié)構(gòu)呈α-螺旋結(jié)構(gòu)的抗菌肽［19］。預(yù)測信號肽（79個(gè)氨基酸）包括3個(gè)結(jié)構(gòu)域：1個(gè)信號肽（22個(gè)氨基酸），1個(gè)C末端 prodomain區(qū)域（35個(gè)氨基酸）和成熟肽（22個(gè)氨基酸），該基因有3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子［20］。Moronecidin抗革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、絲狀真菌（Filamentous fungi）和酵母，包括耐抗生素細(xì)菌，如銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant S.aureus）和耐萬古霉素糞腸球菌（Vancomycin-resistant Enterococcus faecalis）。Moronecidin對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、 表 皮 葡 萄 球 菌（Staphylococcus epidermidis）、 大 腸 桿 菌（E. coli）、 陰 溝 腸 桿 菌（Enterobacter cloacae）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis）、豬霍亂沙門菌（Salmonella choleraesuis）、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica）、白色念珠菌（Candida albicans）、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）均具有較強(qiáng)抗菌活性。

1.2 石斑魚抗菌肽的抗菌譜

Epinecidin-1是從條帶石斑魚（Epinephelus coioides）的鰓和腸道中分離到，含21個(gè)氨基酸殘基保護(hù)魚類免受病原菌感染的一種抗菌肽。完整的epinecidin-1 cDNA 518 bp，預(yù)測含67個(gè)氨基酸的信號肽，包括3個(gè)領(lǐng)域：22個(gè)氨基酸的信號肽，25個(gè)氨基酸的成熟肽，和20個(gè)氨基酸的羧基末端pro區(qū)域，epinecidin-1基因含有3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子［21］。一種酰胺化的成熟肽epinecidin-1具有很強(qiáng)的抗菌活性，對大多數(shù)水產(chǎn)病原菌如副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus），創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus），多殺巴斯德氏菌（Pasturella multocida），溫和氣單胞菌（Aeromonas sobrio），摩氏摩根氏菌（Morganella morganii）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、腦膜膿毒性黃桿菌（Flavobacterium meningosepticum）和大腸桿菌DH5α均有很強(qiáng)的殺菌能力，最低殺菌濃度小于5 μmol。Pan等［22］發(fā)現(xiàn)，石斑魚抗菌肽在已注射嗜鹽弧菌（Vibrio vulnificus）的石斑魚和羅非魚（Tilapia）中存活率顯著增高。

1.3 豹鰨魚抗菌肽的抗菌譜

Paradaxin是最早從豹鰨魚（Pardachirus marmoratus）體內(nèi)分離得到的兩親性陽離子a-螺旋結(jié)構(gòu)并具有穿膜作用的抗菌肽，含33個(gè)氨基酸殘基，具有抗腫瘤活性，該抗菌肽為離子型神經(jīng)毒素［23-24］。Paradaxin分為 ParadaxinI、ParadaxinII兩種，是通過離子交換層析、反相高壓液相色譜法獲得的兩種抗菌肽。ParadaxinI和ParadaxinII分別占豹鰨魚腺體分泌蛋白的10%和8%，ParadaxinI的細(xì)胞毒性是ParadaxinII的5-10倍。Paradaxin對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抗菌活性，對綿羊紅細(xì)胞有溶血活性。

1.4 泥鰍抗菌肽的抗菌譜

Misgurin是由泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）產(chǎn)生的強(qiáng)堿性抗菌肽，含21個(gè)氨基酸殘基，其中含極性帶正電荷的4個(gè)賴氨酸和5個(gè)精氨酸殘基。泥鰍抗菌肽含有1個(gè)親水性甘氨酸對革蘭陰性菌的殺菌能力非常有效。此類抗菌肽由于不含半胱氨酸可折疊成疏水或雙親性α-螺旋結(jié)構(gòu)。泥鰍抗菌肽的等電點(diǎn)為11.84，當(dāng)pH＜pI時(shí)該蛋白質(zhì)帶正電荷，正電荷的引入使抗菌肽的活性增強(qiáng)，而負(fù)電荷的引入可以使抗菌肽的活性減弱，適當(dāng)?shù)募铀峥墒箍咕牡幕钚栽鰪?qiáng)［25］。泥鰍抗菌肽濃度在10 μg/mL以下的時(shí)候?qū)d羊紅細(xì)胞沒有溶血活性。泥鰍抗菌肽能夠殺死大部分革蘭陽性菌，部分革蘭陰性菌及真菌，這種廣譜抗菌的特性是傳統(tǒng)抗生素?zé)o法比擬的。據(jù)Park［26］研究表明，misgurin及合成型misgurin的最低抑菌劑濃度相同，當(dāng)泥鰍抗菌肽濃度為4 μg/mL時(shí)可抑制真菌釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；當(dāng)泥鰍抗菌肽濃度為8 μg/mL時(shí)可抑制革蘭氏陽性菌如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida），同時(shí)可以抑制革蘭氏陰性菌如大腸桿菌（Escherichia coli）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium），還可抑制真菌如新型隱球菌（Cryptococcus neoformans）；當(dāng)泥鰍抗菌肽濃度為16 μg/mL時(shí)可抑制變形鏈球菌（Streptococcus mutans）、沙雷氏菌（Serratia sp.）、白色念珠菌（Candida albicans）。

1.5 臭蛙抗菌肽的抗菌譜

臭蛙抗菌肽是從臭蛙皮膚上產(chǎn)生的含26個(gè)氨基酸殘基的生物活性肽，含帶負(fù)電荷的1個(gè)天冬氨酸和1個(gè)谷氨酸，含帶正電荷的3個(gè)賴氨酸和3個(gè)精氨酸。Conlon［27］認(rèn)為蛙的皮膚表面分布大概250多種顆粒腺體，大部分集中在背部區(qū)域，合成和分泌多種抗菌活性的多肽，并認(rèn)為這些多肽是多種基因復(fù)制的結(jié)果，形成兩性α-螺旋結(jié)構(gòu)。蛙類抗菌肽家族十分龐大，包括brevinin-1、brevinin-2、esculentin-1、esculentin-2、ranalexin、ranatuerin-1、ranatuerin-2和temporin peptides等。

五種抗菌肽的抗菌譜及性質(zhì)，如表1、表2所示。源于魚類和兩棲動物具有抗腫瘤和抗病毒活性的抗菌肽見表3。

2 抗菌肽在畢赤酵母中的表達(dá)

畢赤酵母是一種以甲醇為唯一碳源和能源的酵母，含有甲醇代謝所必須的酶，如醇氧化酶（Alcohol oxidase，AOX）、二羥丙酮合成酶和過氧化氫酶［28］，利用畢赤酵母表達(dá)時(shí)使用最多的是pPIC9K載體，含強(qiáng)有力的啟動子AOXI，能快速篩選高拷貝整合轉(zhuǎn)化株，屬于表達(dá)外源蛋白最高的載體系列［29］?？咕幕蚓幋a根據(jù)畢赤酵母偏愛密碼子設(shè)計(jì)并用化學(xué)方法合成，基因克隆到表達(dá)載體再通過電擊法轉(zhuǎn)入到畢赤酵母，誘導(dǎo)并已成功表達(dá)的有：從冬季比目魚（Winter flounder）分離到的抗菌肽 Pleurocidin［30］，從墨西哥鱷梨果實(shí)中分離抗菌肽PaDef［31］，從雞中分離到的Fowlicidin-2［32］，從巨大天蠶中分離到的 Cecropin B［33］，合成天蠶素雜合肽 Cecropin A（1-8）-Melittin（1-18）［34-35］， 雜 合 抗 菌 肽 CA 和CB［9］等。鱸魚、石斑魚、豹鰨魚、泥鰍和臭蛙抗菌肽已在本實(shí)驗(yàn)室用畢赤酵母成功表達(dá)。畢赤酵母表達(dá)抗菌肽，篩選表達(dá)量高的菌株，通過BMMY培養(yǎng)基加甲醇誘導(dǎo)獲得。通過對抗菌肽的研究，將有利于開發(fā)抗菌肽類藥物，緩解水產(chǎn)養(yǎng)殖遇到的急慢性疾病，避免抗生素帶來的直接或間接耐藥性。

表1 雜交條紋鱸魚、石斑魚、豹鰨魚、泥鰍和臭蛙抗菌肽的抗菌活性

表2 雜交條紋鱸魚、石斑魚、豹鰨魚、泥鰍和臭蛙抗菌肽的性質(zhì)

表3 源于魚類和兩棲動物不同抗菌肽的功能比較

3 結(jié)語

泥鰍、鱸魚和石斑魚均屬于經(jīng)濟(jì)魚類，集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖造成的高密度生物量降低了它們抵抗疾病的能力進(jìn)而引起巨額損失。雖然目前有幾種不同的疫苗已被開發(fā)，包括肌肉或腹腔注射重組蛋白、合成肽、滅活病毒、DNA疫苗、病毒樣顆粒來控制病情。但是，在大多數(shù)情況下，魚類感染病毒通常發(fā)生在早期階段（幼蟲和幼魚時(shí)），注射疫苗非常困難。因此，開發(fā)新的藥物來預(yù)防或治療病毒感染迫在眉睫?？咕淖鳛轭A(yù)防病原菌侵染的重要措施，不同的物種分泌的AMPS抗菌譜有所差異，可用于尋找新的治療耐病原體的藥物［43］。Li等［44］認(rèn)為部分海洋無脊椎動物抗菌肽為多肽，通過研究刪除類似物的效果，發(fā)現(xiàn)許多有抗菌潛力抗菌肽局限于較小天然肽區(qū)。魚類和兩棲類抗菌肽大部分屬于小分子天然肽，因此活性相對較高并具有廣譜的抗菌活性，開發(fā)利用更具有實(shí)際價(jià)值。從魚源中分離的抗氧化劑和抗菌肽可作為食品配方中的功能成分，以促進(jìn)消費(fèi)者的健康和提高食品的保質(zhì)期［45］。通過對抗菌肽的研究，未來將會減少漁業(yè)抗生素濫用、魚肉質(zhì)量低、漁業(yè)養(yǎng)殖病害等問題?？咕淖鳛樾滦偷拿庖呋钚晕镔|(zhì)應(yīng)用于環(huán)境、食品、醫(yī)藥及水產(chǎn)養(yǎng)殖方面有巨大的潛力，有助于改善當(dāng)前藥物的耐藥性、抗生素濫用、環(huán)境污染和食品污染等問題。

目前研究抗菌肽有待解決的問題：探索抗菌肽基因表達(dá)是否受病原體信號的調(diào)節(jié)，這種調(diào)節(jié)機(jī)制與皮膚上潛在的有益微生物競爭或抑制病原體的生長之間的微妙平衡是如何完成的；對于酵母重組表達(dá)的抗菌肽而言，pH、鹽濃度、溫度、消化酶是如何影響抗菌肽活性的；如何采用針對性的方法規(guī)?；a(chǎn)和純化抗菌肽，提高抗菌肽在體內(nèi)的穩(wěn)定性并應(yīng)用于食品配料、醫(yī)藥和水產(chǎn)養(yǎng)殖方面。充分解決上述問題才能更好地應(yīng)用市場發(fā)揮作用。

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Research Advances on Antimicrobial Peptides of Fish and Amphibians

XUE Lin-gui1，2MA Ping1，2SHANG Hai1，2HE Xiao-yan1，2CHEN Xi-ming2LIU Guang-xiu2CHEN Tuo2ZHANG Wei2
（1.School of Chemical and Biology Engineering，Lanzhou Jiaotong University，Lanzhou 730070；2. Northwest Institute of Eco-Environment and Resources，Chinese Academy of Sciences，Lanzhou 730070）

At present，750 antimicrobial peptides have been successfully isolated from the biological community，of which with antitumor activity account for about 13.1%. The antibacterial peptides derived from amphibians and fish are about 13.3% and 9.3%，respectively. Fish and amphibians are the most primitive vertebrate，and most of them rely on the gills，skin and intestinal breathing. Due to their extremely fragile acquired immune system，they have a powerful innate immune system to avoid the infection of the pathogen，thus the antimicrobial peptides distributed in different parts have become the important component of first defense line of broad-spectrum in these lower organisms. This paper reviewed the broad-spectrum antibacterial activity and immune regulation ability of antibacterial peptides such as moronecidin，epinecidin-1，paradaxin，and misgurin distributed in hybrid striped bass，Epinephelus coioides，Pardachirus marmoratus，and Misgurnus anguillicaudatusis，as well as antibacterial spectrum of smelly frog antimicrobial peptide. For instance，the moronecidin can kill all gram positive bacteria and some gram negative bacteria. Epinecidin-1 can effectively prevent the infection of vulnificus（Vibrio vulnificus）in grouper and kill the nervous necrosis virus. Paradaxin reveals the antitumor activities. Misgurin has strong bactericidal ability. Antibacterial peptides from the smelly frog can kill Candida albicans. Then，the paper summarized the antibacterial peptides successfully expressed in Pichia pastoris and those derived from fish and amphibian of having antiviral and antitumor activities. Finally，the paper discussed the problems and solutions in the application of these antibacterial peptides，providing a theoretical basis for green and effective antibacterial peptide drugs in various fields to play a great role.

antimicrobial peptides；antimicrobial spectrum；Pichia pastoris

2017-07-19

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260135，31400437），甘肅省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（1504FKCA015），蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015-3-68）

薛林貴，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：微生物工程，環(huán)境微生物；E-mail：xuelg@mail.lzjtu.cn

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0599

（責(zé)任編輯 狄艷紅）