Wnt10A基因促進胃癌細胞增殖與遷移作用及機制探討

郭會燦

（石家莊職業技術學院，石家莊 050081）

Wnt10A基因促進胃癌細胞增殖與遷移作用及機制探討

郭會燦

（石家莊職業技術學院，石家莊 050081）

闡明Wnt10A基因在胃癌細胞增殖及遷移中的功能及探索潛在的分子機制，為胃癌診斷、治療提供新的靶點分子。以熒光定量PCR及免疫印跡技術檢測基因表達，以RNAi技術敲減Wnt10A基因，以MTT法、劃痕及transwell實驗檢測細胞行為學變化。結果顯示，Wnt10A基因在胃癌組織中表達量均顯著高于癌旁對照，平均差異達到3倍。并且Wnt10A基因在胃癌細胞系中表達量也高于正常細胞GES。當Wnt10A基因在胃癌細胞AGS中表達被成功下調約60%后，AGS細胞增殖率下降40%，遷移率下降約40%，侵襲能力也降低約70%。免疫印跡實驗表明Wnt10A下調后，β-catenin、Cyclin D、TCF以及Myc基因表達量下調，而DKK1與GSK3β表達增強，與LGK-974處理結果一致。Wnt10A基因通過模擬激活Wnt/β-catenin/Myc信號通路促進胃癌細胞增殖與遷移，發揮促癌基因的功能。

Wnt10A；胃癌；AGS；Wnt/β-catenin信號

胃癌是嚴重威脅人類生命安全的十大惡性腫瘤之一，發病率與死亡率一直居高不下，并且呈現穩步增長趨勢。世界癌癥研究報告數據顯示，2017年在美國胃癌的新增病例為28 000例，死亡病例為10 960例，分別占據十大腫瘤發病率第二、死亡率第一的位置［1］。中國面臨的形勢更嚴峻，據2015年統計預測新增胃癌病例約733 300例，新增死亡人數為610 200例［2］。然而，目前針對胃癌主要還是以手術切除為主，并給予放化療輔助治療。但是臨床預后較差、發現晚，極大地降低了胃癌患者生存概率，其主要原因是缺乏胃癌早期診斷標志物，以及對胃癌發病機理缺乏充分的認識［3］。大量研究數據表明，癌癥的發生發展是一個多因素參與的復雜過程，基因突變、缺失、表達失調導致細胞生長、遷移特性異常或紊亂是癌癥發生發展的常見機制。同樣，胃癌中關鍵分子及關鍵信號途徑仍有待挖掘［4-5］。

研究表明，Wnt信號通路過度激活以及關鍵調節蛋白的改變與腫瘤的發生發展密切相關［6-8］。Wnt配體家族有19個成員，其中Wnt10A基因被報道促進腎細胞癌發生，發揮癌基因功能［9-10］。同時有研究表明，在胃癌細胞系和原發性胃癌組織中Wnt10A基因表達也增強［11］。而且TNFα和幽門螺桿菌感染均誘導Wnt10A基因表達上調。幽門螺桿菌是胃炎的元兇，并且會導致胃癌的形成［11］，但Wnt10A基因在胃癌中的功能及分子機制尚無報道。

本研究通過基因干擾技術下調胃癌細胞AGS細胞中Wnt10A表達，檢測AGS細胞增殖、遷移的改變，并以免疫印跡技術探索Wnt10A在胃癌發生、發展中參與調控的信號機制。

1 材料與方法

1.1 材料

40例冰凍胃癌樣本組織及對應癌旁組織來源于河北醫科大學第一醫院病理科。胃癌細胞系AGS、MGC-803、SGC-7901及對照細胞系GES購自中科院上海細胞庫，細胞培養于DMEM培養基（含10%FBS）。

1.2 方法

1.2.1 siRNA合成與轉染 以在線軟件設計并合成2條靶向Wnt10A基因編碼區的siRNA片段（siWnt10A-1與 siWnt10A-2），如表 1所示。參考Invitrogen公司Lipofectamine2000使用手冊以脂質體轉染法將siRNA片段與細胞共培養6 h，然后更換新鮮培養基繼續培養細胞。

表1 靶向Wnt10A基因siRNA靶點序列

1.2.2 MTT實驗 分組：siRNA對照組（NC組）、Wnt10A-siRNA-1組、抑制劑對照組（DMSO組）、LGK-974組、聯用組（Wnt10A-siRNA-1/LGK-974組）；其中LGK-974實驗劑量為0.6 nmol/L。

準備96孔板，按照2 000個細胞/孔接種胃癌細胞，3個復孔/組，按照1.2.1方法轉染siRNA片段，繼續培養至120 h，每24 h取一組細胞棄上清并加入20 μL MTT試劑（5 mg/mL），繼續孵育4 h，棄上清并加入200 μL DMSO試劑，振蕩30 s，以酶標儀檢測490 nm波長讀值。計算細胞增殖率。

1.2.3 劃痕實驗 準備6孔板，按照200 000個細胞/孔接種胃癌細胞，3個復孔/組，按照1.2.1方法轉染siRNA片段，24 h后觀察細胞融合度達到90%，以10 μL移液槍頭制造1個劃痕并以含2%FBS的DMEM培養基繼續培養48 h。顯微鏡下觀察細胞遷移情況，并分別在24 h、72 h兩個時間點測量劃痕距離（S24h、S72h），計算細胞遷移率，計算公式為migration rate=（S24h-S72h）/S24h。

1.2.4 Transwell實驗 取BD公司transwell小室（上室，孔徑8 μm），按照20 000個細胞/孔接種siRNA處理過的胃癌細胞，3個復孔/組，將上室置于24孔板（下室）中，下室中加入500 μL含20%FBS的DMEM培養基。48 h后，取出上室，刮去上室內側細胞，上室外側細胞以0.1%結晶紫染色并以甲醇固定。顯微鏡下觀察穿膜細胞數量并計數，評估細胞侵襲能力。

1.2.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR） 參考Invitrogen公司的TRIZOL產品手冊提取胃癌組織及細胞系中總RNA并以Promega公司的核酸酶處理RNA。以 1 μg RNA 為 模 板 逆 轉 錄 合 成 cDNA， 取 2 μL cDNA為模板，以SYBR Green方法進行qRT-PCR。以GAPDH為內參，按照2-△Ct方法計算目的基因相對含量。△Ct=Ct（目的基因）-Ct（GAPDH）。

1.2.6 免疫印跡實驗 以商業蛋白提取試劑盒提取細胞中總蛋白并以BCA方法定量。取15 μg總蛋白以10% SDS-PAGE電泳分離并以濕轉染將目的蛋白轉移至PVDF膜上，以第一抗體包括Wnt10A抗體（ab62051，Abcam）、DKK1（ab109416，Abcam）、TCF（ab69999，Abcam）、β-catenin（ab32572，Abcam）、cyclin D1（ab134175，Abcam）、GAPDH（ab9484，Abcam）孵育PVDF膜，4℃過夜，然后以相應第二抗體孵育PVDF膜，以ECL kit曝光檢測目的基因表達量。

1.2.7 數據分析 所有實驗均至少重復3次，并表示為平均值±標準差（x-±s）。Student’t檢驗用于評價各實驗組之間是否具有顯著差異。*P＜0.05表示具有顯著差異。

2 結果

2.1 Wnt10A基因在胃癌細胞中高表達

借助熒光定量PCR技術（qPCR）及免疫印跡技術（WB）分析發現，在多株胃癌細胞系中，Wnt10A基因表達明顯強于正常胃上皮細胞GES-1。如圖1-A所示，在3株胃癌細胞系AGS、MGC-803、SGC-7901中Wnt10A基因的mRNA表達顯著高于對照細胞GES-1，其中以AGS細胞中Wnt10A表達最強。而且在蛋白表達水平，Wnt10A基因在3株胃癌細胞系中表達也明顯高于GES-1細胞中（圖1-B）。同時，以qPCR技術也發現在40例胃癌組織中Wnt10A基因表達也明顯高于癌旁正常組織，平均表達水平增強約3倍（圖1-C）。因此，Wnt10A基因在胃癌發生、進展中可能有重要意義。

2.2 Wnt10A基因在胃癌細胞AGS中被成功敲減

如表1，設計、合成2個siRNA片段即siWnt-10A-1余siWnt10A-2。然后，通過lipo2000將這2個siRNA片段分別導入AGS細胞中。共培養48 h后，通過qPCR與WB方法分析發現AGS細胞中Wnt10A基因在AGS細胞中被顯著降低。如圖2所示，Wnt10A基因在mRNA與蛋白水平分別降低達60%與54%。因此，表明成功敲減胃癌細胞AGS中Wnt10A基因的表達。

圖1 Wnt10A基因表達模式

2.3 敲減Wnt10A基因抑制AGS細胞增殖

當降低Wnt10A基因表達后，發現AGS細胞增殖能力明顯減弱。如圖3所示，轉染siRNA片段后120 h，AGS細胞增殖率降低40%以上。這些數據表明Wnt10A基因對胃癌細胞生長有促進作用。

2.4 敲減Wnt10A基因降低AGS細胞遷移及侵襲能力

以劃痕實驗分析發現敲減Wnt10A基因表達后，AGS細胞的遷移率降低達40%（圖4-A與4-C）。同時在transwell實驗中，AGS細胞侵襲能力也顯著減弱，幅度達到70%以上（圖4-B與4-D）。因此，Wnt10A有利于胃癌細胞遷移及侵襲。

圖2 Wnt10A基因被成功敲減

圖3 Wnt10A基因敲減阻滯AGS細胞生長

2.5 Wnt10A基因模擬調控Wnt/β-catenin/Myc信號通路

如圖5-A，敲減Wnt10A基因后，經典Wnt信號通路中的關鍵分子如β-catenin、Cyclin D1、TCF以及Myc基因表達量下調，而DKK1與GSK3β表達增強。該數據與以Wnt信號抑制劑LGK-974處理AGS細胞得到的結果一致，并且LGK-974與Wnt10A敲減之間無協調效應或疊加效應。如圖5-B，聯用組LGK-974/ siWnt10A-1與單獨組siWnt10A-1的AGS細胞增殖無顯著差異（P＜0.05）。據此推斷，在胃癌細胞中Wnt10A基因模擬調控Wnt/β-catenin/Myc信號活性。

圖4 Wnt10A基因敲減抑制AGS細胞遷移及侵襲

圖5 Wnt10A基因調控Wnt/β-catenin信號

3 討論

Wnt10A基因是Wnt信號配體家族成員之一，而大量研究數據表明Wnt信號通路對促進腫瘤細胞生長起重要的作用。因此推測Wnt10A基因在腫瘤進程中可能也發揮一定作用。借助qPCR技術，我們檢測在胃癌組織樣本中Wnt10A基因表達量顯著高于癌旁正常組織。進一步發現在常見胃癌細胞系中Wnt10A基因在RNA及蛋白水平也顯著高于正常胃上皮細胞。這些數據進一步支持我們的推測，即Wnt10A在胃癌發生、發展中有臨床意義。已有研究報道表明Wnt10A在食道癌、淋巴瘤、結直腸癌組織中也呈高水平表達［9，12-13］。同時有報道證實Wnt10A基因在腎癌的發生、進展過程中發揮促癌基因的作用［10］。腫瘤具有兩大顯著特征即無限制生長與侵襲能力強［14］。在本研究中，我們發現Wnt10A基因下調后，胃癌細胞的增殖能力、侵襲及遷移能力均大幅度下降。這表明Wnt10A基因的高表達促進胃癌細胞增殖、遷移及侵襲行為。因此，體外功能實驗與組織表達模式提示Wnt10A在胃癌中也發揮促癌基因的功能。

Wnt信號家族已發現19個成員，大量研究表明Wnt分子表達增強或功能異常在各種腫瘤中均發揮重要作用。在Wnt/β-catenin信號途徑中，Wnt分子結合相應受體激活Dishevelled蛋白，抑制GSK3β導致β-catenin分子集聚及核內移，進而結合TCF/LEF因子，促進下游靶基因表達。促進細胞生長、增殖［15］。

在本研究中，我們發現Wnt10A基因下調后，經典Wnt信號通路中的關鍵分子包括β-catenin、Cyclin D、TCF與LEF分子表達顯著降低。而Wnt10A-受體結合率降低導致Dishevelled蛋白活性減弱，從而解除對GSK3β的抑制作用，增強GSK3β表達。因為GSK3β分子可促進β-catenin的磷酸化水平升高，進一步降解β-catenin，從而抑制Wnt信號激活。同時DKK1基因表達量也顯著增強。DKK1可結合受體LRP5/6，促進膜受體內吞作用，減少膜上受體占有率。而LRP5/6受體對Wnt配體結合對應Frizzled受體并激活下游信號通路發揮關鍵作用［17］。因此DKK1表達增強必將阻斷Wnt信號激活。

當我們以Wnt信號的小分子抑制劑LGK-974處理AGS細胞發現LGK-974單獨作用、si-Wnt10A單獨作用、LGK-974與si-Wnt10A聯合作用均可以顯著抑制AGS細胞生長，但是聯合作用組與單獨處理組無顯著差異，表明si-Wnt10A與LGK-974之間無顯著疊加效應或協同效應。LGK-974是經典Wnt/βcatenin信號通路阻斷劑，可特異性結合Wnt下游porcn蛋白，抑制Wnt信號。這些數據表明在胃癌細胞中Wnt10A基因通過模擬調控經典Wnt/β-catenin信號通路促進胃癌細胞生長與遷移。Myc基因是一個原癌基因，大量研究表明Myc基因在腫瘤組織及腫瘤細胞中表達量明顯增強，腫瘤細胞增殖能力也顯著提高［16-17］。而且Myc基因參與腫瘤細胞代謝，有利于細胞生長［17］。在本研究中，我們發現敲減Wnt10A基因后，Myc基因表達量顯著降低。而體外細胞功能實驗已經證明Wnt10A基因下調后，胃癌細胞增殖能力明顯降低。所以，在分子水平和細胞水平均證明Myc基因對Wnt10A基因的功能非常關鍵。基于以上數據分析，我們提出在胃癌細胞中，Wnt10A基因通過模擬調控Wnt/β-catenin/Myc信號途徑發揮促進癌細胞生長及遷移的作用。

4 結論

Wnt10A基因在胃癌細胞系及組織中均呈高水平表達，并且Wnt10A通過模擬激活Wnt/β-catenin/Myc信號通路促進胃癌細胞增殖與遷移，發揮促癌基因的功能。

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The Promoting Role of Gene Wnt10A in Proliferation and Migration of Gastric Cancer Cells and the Underlying Mechanism

GUO Hui-can
（Shi Jia Zhuang University of Applied Technology，Shijiazhuang 050081）

This work aims to elucidate the function of gene Wnt10A during the proliferation and migration of gastric cancer cells and the underlying molecular mechanism，for providing new target molecule in the diagnosis and treatment of gastric cancer. Real-time quantitative PCR and Western bolt analysis were used to detect gene expression；RNAi technology was applied to knockdown and decrease the expression of Wnt10A，and MTT assay，wound healing assay and transwell assay were employed to detect the biological behavior of gastric cancer cells.Results showed that gene Wnt10A expressed more highly in tumor tissues than that in adjacent normal tissues，approximately 3 times. The level of Wnt10A in gastric cancer cell lines was also higher than the normal cells GES. The proliferation rate of AGS cells reduced by 40%，the migration rate decreased by 40%，and the invasive ability was also downregulated about 70%，when the expression level of gene Wnt10A in AGS cells decreased about 60%. Furthermore，Western blot analysis demonstrated that the expressions of β-catenin，Cyclin D，TCF and gene Myc reduced after Wnt10A knockdown in AGS cells，while the expression levels of DKK1 and GSK3β increased，which was in consistent with the results by the treatment of LGK-974，a specific inhibitor against Wnt/β-catenin signaling. Conclusively，gene Wnt10A promotes the proliferation and migration of gastric cancer cells through simulating activation of Wnt/β-catenin/Myc signaling pathway，i.e.，functions as cancer-promoting gene.

Wnt10A；gastric cancer；AGS；Wnt/β-catenin signaling

2017-05-26

郭會燦，女，碩士，副教授，研究方向：生物制藥；E-mail：heweibingkkk@126.com

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0434

（責任編輯 朱琳峰）