基因工程法合成間苯三酚

崔鑫 閻振鑫 宋偉國， 林文瀚 彼得·普勞克斯，

（1. 濰坊科技學院化工與環境學院，濰坊 262700；2. 壽光富康制藥研發部，濰坊 262700）

基因工程法合成間苯三酚

崔鑫1閻振鑫2宋偉國1，2林文瀚2彼得·普勞克斯1，2

（1. 濰坊科技學院化工與環境學院，濰坊 262700；2. 壽光富康制藥研發部，濰坊 262700）

為進一步提高生物法合成間苯三酚的效率，探究生物合成間苯三酚的分子機理以及更加高效的發酵條件和培養基成分。對來自熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）的phlD基因進行了克隆，在BL21（DE3）中重建間苯三酚的胞內合成途徑，超表達多重抗藥基因正向調節因子（marA）和乙酰輔酶A羧化酶（ACCase），并分析不同碳源及培養基離子環境對間苯三酚積累量的影響。結果顯示，成功構建間苯三酚胞內合成途徑，產量達到450 mg/L，marA基因能夠提高工程菌對間苯三酚抵抗力，使間苯三酚產量提高到1 060 mg/L；ACCase能夠提高胞內丙二酰輔酶A的含量，使間苯三酚產量提高到2 120 mg/L；葡萄糖、甘油和丙酮酸鈉三種碳源的比較中，葡萄糖對合成間苯三酚最為有利，分別是甘油和丙酮酸鈉的1.8倍和2.4倍；培養基中鈣鎂離子對間苯三酚的合成沒有影響。marA和ACCase基因的超表達能大大提高間苯三酚生物合成的效率，以葡萄糖為碳源的無鈣鎂培養基為間苯三酚發酵的最適培養基。

間苯三酚；MarA；ACCase；PhlD

間苯三酚及其衍生物在自然界中分布廣泛，在多種植物和微生物中都有分布［1］。間苯三酚是一種重要的醫藥中間體和有機合成中間體，具有良好的抗病毒［2］、抗腫瘤［3］、抗菌、消炎［4］、止血及收縮子宮［5］等藥理活性，市場前景極為廣闊。其在國內外的需求量逐年上升，而傳統的化學合成法生產技術落后，環境污染嚴重，產品質量跟不上醫藥產業的發展。

Weller和Achkar等［6-7］發現在熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）中phlACBD 操縱子可以合成2，4-二乙酰基間苯三酚（2，4- DA PG），而phlD是其中的關鍵基因，phlD與III型聚酮合酶（PKSIII）之一查爾酮合酶（Chalcone synthase，CHS）結構和功能的相似性很高［8］。間苯三酚本身可作為黃酮及類黃酮合成的中間體，其合成和代謝途徑與CHS催化合成黃酮及類黃酮類物質的途徑相似［9］。在大腸埃希菌胞內的碳循環途徑中存在少量丙二酰輔酶A，phlD可利用3分子的丙二酰輔酶A合成1分子的間苯三酚［7］，單獨克隆phlD基因可合成間苯三酚［10-12］。在phlD的異源表達方面前人已經做了較多研究。例如，Achkar等［7］在phlD的異源表達研究中將間苯三酚的產量提高到780 mg/L；Rao等［13］在phlD異源表達的穩定性方面所做的研究使phlD蛋白在37℃下的半衰期比野生型提高了24倍。然而，由于目前單位產量低，生產成本高，間苯三酚的生物合成法沒有在工業生產中被推廣應用。

導致生物合成法產量低的關鍵問題是：（1）間苯三酚是多種抗生素的前體［14］，具有較強的抑菌能力，且其水溶液呈酸性，在培養基中積累后嚴重抑制工程菌的生長；（2）phlD合成間苯三酚的直接前體丙二酰輔酶A在大腸埃希菌胞內含量較低，且胞內存在多條消耗丙二酰輔酶A的競爭性代謝通路［15］。大腸埃希菌多重抗藥基因正向調節因子（marA）能參與調控60多個基因的轉錄，能提高大腸埃希菌的主動外排泵系統（AcrAB-TolC）的外排能力，提高大腸埃希菌對抗生素的抵抗能力［16-17］。乙酰輔酶A羧化酶（ACCase，EC 6.4.1.2）可以催化乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A［18］。所以在大腸埃希菌細胞中超表達marA和ACCase能夠較好的解決上文提到的這兩個問題。

雖然對phlD基因的研究論文較多，但是與marA及ACCase關聯研究并且對培養基的碳源及離子環境進行綜合探索的研究未見報道。本研究克隆并超表達基因MarA和ACCase，以提高細胞對間苯三酚的抵抗能力和胞內丙二酰輔酶A的含量［13］；探究甘油、葡萄糖、丙酮酸鈉等不同碳源以及Mg2+和Ca2+對間苯三酚產量的影響，旨在使生物合成法制備間苯三酚的成本進一步降低。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質粒 本研究所用菌株和質粒均為本研究構建和實驗室購買自全式金生物技術有限公司和Novagen公司，詳見表1。

表1 本實驗所用的質粒與菌株

1.1.2 酶、引物及相關試劑盒 高保真DNA聚合酶KOD-plus購自TOYOBO（東洋紡），Taq DNA聚合酶、質粒小提試劑盒、DNA純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒及細菌總DNA提取試劑盒均購自全式金生物技術有限公司，限制性內切酶及T4連接酶購自Thermo Scientific公司，PCR引物（表2）由生工生物（上海）有限公司合成。間苯三酚色譜級標準品購自Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 培養基 LB培養基（g/L）：蛋白胨10.0，氯化鈉10.0，酵母粉5.0，用1N氫氧化鈉調整pH為7.4；制備固體培養基時添加2%的瓊脂。TB 培養基（g/L）：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，氯化鈉1.0，磷酸二氫鉀17 mmol/L，磷酸氫二鉀72 mmol/L，用1N氫氧化鈉調整pH為7.4。M9改良培養基（g/L）：磷酸氫二鈉3.0、磷酸二氫鉀1.5、氯化銨0.5，蛋白胨10.0。

表2 本實驗使用到的引物

1.2 方法

1.2.1 培養方法 種子培養：挑取生長良好的單一菌落，接種于25 mL LB液體培養基中，37℃、220 r/min，震蕩培養24 h。搖瓶發酵培養：將2%種子培養液接種于100 mL TB培養基中，37℃、220 r/min，震蕩培養至光密度值optical density，OD值0.6-0.8，加入誘導劑異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至0.1 mmol/L，24℃、160 r/min 培養48 h，定時取樣，檢測間苯三酚的積累量。

M9培養基發酵：將2%種子培養液接種于100 mL M9培養基中，37℃、220 r/min，震蕩培至OD值0.6-0.8，加IPTG至0.1 mmol/L，32℃、160 r/min培養24 h，HPLC檢測間苯三酚的積累量。

1.2.2 基因的擴增與質粒的構建 從GenBank數據庫獲得熒光假單胞菌（P. fluorescens F113）來源的phlD基因序列（GenBank ID：11830552）。phlD經大腸埃希菌密碼子偏好性修改后，合成其全基因序列。將phlD及pET28a分別用Nde I和BamH I雙酶切，連接得到重組質粒pET28a-phlD（圖1-A），測序確認。

以E. coli DH5α全基因組DNA為模板，擴增marA（GenBank ID ：947613）、accA（GenBank ID ：944895）、accBC（GenBank ID ：947758，GenBank ID：947761） 和 accD（GenBank ID：946796）。 將marA插入pACYCDuet-1得到重組質粒pA-marA（Nco I和BamH I，圖1-B）。以pA-marA質粒為PCR模板，克隆連接有T7啟動子的marA，并插入pET28a-phlD質粒，得到pET28a-phlDmarA重組質粒（Sal I和Xho I，圖1-C）。將accA和accD分別插入pACYCDuet-1質粒，得到重組質粒pA-accA（Nco I和BamH I）和pA-accD（Nco I和BamH I）；以 pA-accD為模板克隆T7accD片段，并插入pA-accA得到重組質粒pA-accAD（Sal I和Hind III）；最后將 accBC插入 pA-accAD質粒的得到重組質粒pA-accADBC（Nde I和Xho I，圖1-D）。用T7引物與基因特異引物組合法進行重組子的PCR篩選，并測序確認。

1.2.3 分析方法 HPLC法定量檢測發酵液中間苯三酚的含量具體條件參見《歐洲藥典》8.7版，流動相A為1.36 g/L的磷酸二氫鉀溶液，用磷酸調pH至3.0；流動相B為乙腈，梯度洗脫；色譜柱為C18反相柱Thermo SCIENTIFIC syncronis Dim（mm）250*4.6，粒徑5 μm。流速為1.0 mL/min柱溫 30℃，進樣量 20 μL，檢測器為紫外檢測器，檢測波長 265 nm。間苯三酚標準品保留時間約為8.9 min，標準曲線為：C=0.296 5S+32.1（C代表間苯三酚濃度，單位：mg/L；S代表峰面積）相關系數R2=0.999。

H-NMR分析確認發酵液中間苯三酚結構，核磁共振譜采用DMX20型核共振儀（Bruker公司）測定。

2 結果

2.1 phlD、marA、accA、accD和accBC基因的克隆及pET28a-phlDmarA和pA-accADBC表達質粒載體的構建

PCR克 隆 獲 得 phlD、marA、accA、accD和accBC基因的CDS區序列，結果見圖2，經測序分析，其大小分別為1 050 bp、384 bp、960 bp、915 bp和1 830 bp，與GenBank所登記序列大小一致。

圖1 原核表達phlD、marA和 ACCase 的重組質粒圖譜

重 組 質 粒 pET28a-phlD、pET28a-phlDmarA、pA-accAD和pA-accADBC的質粒酶切圖譜見圖3，經BGI測序，確認重組質粒包含完整插入基因序列且無突變。

圖2 phlD的全合成以及marA、accA、accD和accBC克隆瓊脂糖凝膠電泳

2.2 BL21（DE3）胞內間苯三酚合成途徑的構建

圖3 重組質粒pET28a-phlD、pET28a-phlDmarA、pA-accAD和pA-accADBC的酶切鑒定圖譜

將重組表達質粒pET28a-phlD轉入BL21（DE3）細胞，誘導表達，進行SDS-PAGE蛋白分析，成功檢測到phlD蛋白（圖4-A）。取40 h發酵液經乙酸乙酯萃取后進行TLC及HPLC分析，在TLC分析中樣品斑與陽性對照一致；在HPLC分析中樣品出峰時間（8.9 min）及光譜峰與標準品均一致。使用葡萄糖-TB培養基發酵，經HPLC標準曲線定量，間苯三酚產量達到520 mg/L（使用LB培養基產量僅為350 mg/L，TB培養基改善了發酵液的pH環境）。發酵液經乙酸乙酯萃取濃縮后用DMSO溶解進行1HNMR檢測，確認了間苯三酚的存在，如圖5。間苯三酚標準品1H NMR（400 MHz，DMSO）：δ8.95（s，3H），5.65（s，3H）；間苯三酚樣品1H NMR（400 MHz，DMSO）：δ8.95（s，3H），5.66（s，3H）。

圖4 SDS-PAGE蛋白分析

圖5 1H-NMR鑒定

2.3 超表達marA及ACCase對提高間苯三酚產量及積累速度的影響

將pET28a-phlDmarA和pA-accADBC兩個質粒轉化BL21（DE3）細胞，超表達蛋白（箭頭標注）的分子量依次與AccC、PhlD、AccA、AccD（與AccA亞基分子量相近合并為一條帶）、AccB和MarA的理論大小一致，見圖4-B。

使用2.5%葡萄糖碳源TB培養基分別進行搖瓶發酵對比實驗（圖6，n=3），IPTG誘導后8、16、24、32、40和48 h取樣，HPLC檢測間苯三酚積累量（圖6）。數據顯示間苯三酚積累峰值在40 h左右出現，之后濃度逐漸降低。同時超表達phlD和marA的最高產量（1 060 mg/L）是僅超表達phlD最高產量（450 mg/L）的2.35倍，經T檢驗分析具有極顯著差異（P＜0.01）；同時超表達phlD、marA和ACCase的最高產量（2 120 mg/L）是僅超表達phlD最高產量的4.71倍，經T檢驗分析具有極顯著差異（P＜0.01）；是同時超表達phlD和marA的最高產量的2倍，經t檢驗分析具有極顯著差異（P＜0.01）。在前24 h間苯三酚呈線性累積，24 h之后生產效率逐漸下降。超表達marA及marA&ACCase明顯提高了間苯三酚的積累速度和積累峰值，尤其是marA&ACCase的超表達使前24 h的積累速度大幅提高，說明marA可以有效提高細菌對間苯三酚的抵抗能力以及ACCase的表達使胞內丙二酰輔酶A的供應量有一定水平的增加。

圖6 marA及ACCase對間苯三酚積累速度的影響（每組3個重復）

2.4 葡萄糖、甘油和丙酮酸鈉不同碳源及Ca2+/Mg2+對間苯三酚產量的影響

培養基1、2和3分別為每升M9改良培養基中添加25 g葡萄糖、甘油或丙酮酸鈉。培養基1、2和3中分別加入2 mmol/L Mg2+和0.1 mmol/L Ca2+成為鈣鎂培養基。分別使用以上培養基進行發酵實驗，HPLC檢測間苯三酚積累量，如圖7。使用葡萄糖碳源的工程菌產量達到490 mg/L，是使用甘油碳源產量（275 mg/L）的1.8倍，經t檢驗分析具有極顯著差異（P＜0.01）；是使用丙酮酸鈉碳源產量（205 mg/L）的2.4倍，經t檢驗分析具有極顯著差異（P＜0.01）。鈣鎂離子對間苯三酚的積累沒有影響。

圖7 葡萄糖、甘油和丙酮酸鈉不同碳源及Ca2+/Mg2+對間苯三酚產量的影響

3 討論

影響間苯三酚產量的主要原因在前言中已提及：間苯三酚的抑菌性及phlD直接底物的缺乏。在BL21（DE3）細胞中超表達marA基因和ACCase，部分解決了前言中提及的這兩個問題，使間苯三酚的產量得到大幅提升，最高產量達到約2 120 mg/L，是同類研究中搖瓶發酵的最高產量。發酵后期間苯三酚濃度的降低與間苯三酚本身結構不穩定有關［19］。進一步降低發酵溫度，可提高間苯三酚的穩定性，從而提高間苯三酚的積累峰值。但是溫度的降低也會提高生產成本，拉長發酵周期，平衡考慮或不可取。

MarA的超表達雖然緩解了間苯三酚對工程菌的抑制作用，但是間苯三酚的積累卻進一步降低了發酵液的pH值，形成了新的矛盾。我們通過使用改良TB培養基來緩解了pH的矛盾，使間苯三酚產量進一步提升，且積累速度大幅提升。ACCase的超表達雖然提高了胞內丙二酰輔酶A的濃度，使間苯三酚產量有了較大的提升，但是大量的蛋白超表達以及間苯三酚生物合成對胞內碳資源的爭奪，抑制了工程菌的生長，使工程菌的最終OD值降低，制約了間苯三酚的生物合成，降低了培養基的利用率，增加了成本。

細胞中乙酰輔酶A主要來源于丙酮酸氧化脫羧［20］，在培養基中添加丙酮酸鹽以期提高胞內乙酰輔酶A的含量，進而增加ACCsae酶的底物濃度，達到提高丙二酰輔酶A濃度的目的。但是，通過與葡萄糖、甘油對比實驗發現效果不理想。可能是因為細胞膜上缺少相關轉運蛋白，而帶負電的丙酮酸根很難直接穿過細胞膜被細胞直接吸收。雖然葡萄糖要經過復雜的糖酵解途徑在胞內才能生成丙酮酸，但是大腸埃希菌細胞膜上具有成熟的吸收葡萄糖的磷酸酶轉移系統［21］，有極高的吸收效率。所以最終還是葡萄糖對間苯三酚的積累更加有利。

4 結論

本研究通過在BL21（DE3）菌株中異源表達來自熒光假單胞菌的phlD基因，成功構建間苯三酚的胞內生物合成途徑；同時超表達了來自E.coli DH5α菌株的marA和ACCase基因，提高了工程菌對間苯三酚的抵抗能力，提高了胞內合成間苯三酚的直接底物丙二酰輔酶A的含量。

不同碳源及培養基中離子環境對間苯三酚產量的影響：葡萄糖為最佳發酵碳源，且鈣鎂離子對間苯三酚的產量沒有影響。本研究使間苯三酚的產量得到大幅的提升，達到2 120 mg/L的水平，為目前搖瓶發酵的最高產量。

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Genetic Engineering for Production of Phloroglucinol

CUI Xin1YAN Zhen-xin2SONG Wei-guo1，2LIN Wen-han2Peter PROKSCH1，2
（1. School of Chemical Engineering and Environmental，Weifang University of Science and Technology，Weifang 262700 ；2. Shouguang Fukang Pharmaceutical Co. Ltd.，R&D.，Weifang 262700）

This work is to further improve the efficiency of phloroglucinol biosynthesis，and to investigate the molecular mechanism of phloroglucinol biosynthesis and more efficient fermentation conditions and media components. We cloned the phlD gene from Pseudomonas fluorescens and reconstructed the intracellular synthesis pathway of phloroglucinol in the BL21（DE3）. At the same time the multi-drug resistant regulator（marA）and acetyl-coA carboxylase（ACCase）were also super-expressed in the BL21（DE3），and the effects of different carbon sources and medium ion environment on the phloroglucinol accumulation were analyzed. The results showed that intracellular synthesis pathway of phloroglucinol was successfully established，and the yield reached 450 mg/L. The marA gene increased the resistance of engineering strain to phloroglucinol and thus phloroglucinol yield increased to 1060 mg/L. The ACCase improved the content of the intracellular malonyl-CoA，and increased the phloroglucinol yield up to 2120 mg/L. Compared to glycerin and sodium pyruvate，glucose was the most suitable for the phloroglucinol biosynthesis，and the phloroglucinol yield with glucose was 1.8 times and 2.4 times of that with glycerol and pyruvate，respectively. Calcium and magnesium ions in medium had no impact on the phloroglucinol synthesis. Conclusively，the superexpression of the marA and ACCase genes can greatly increase the efficiency of phloroglucinol biosynthesis，and the medium using glucose as carbon source and without no calcium and magnesium is the optimal for phloroglucinol biosynthesis.

phloroglucinol；MarA；ACCase；PhlD

2017-06-30

海洋生物醫藥間苯三酚等制劑國際化發展能力建設項目［魯財建指2014（No.18）］

崔鑫，男，本科，研究方向：小分子化學藥物的生物合成；E-mail：731130528@qq.com

宋偉國，男，博士，研究員，研究方向：生物醫藥；E-mail：songwg@139.com

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0542

（責任編輯 李楠）