一種快速檢測(cè)含tst基因的金黃色葡萄球菌的納米生物傳感器

李明陽 賀氣志 馬春霞 俞建昆

（1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所 中心實(shí)驗(yàn)室，昆明 650118；2. 長沙醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 應(yīng)用生物學(xué)教研室，長沙 410219）

一種快速檢測(cè)含tst基因的金黃色葡萄球菌的納米生物傳感器

李明陽1賀氣志2馬春霞1俞建昆1

（1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所 中心實(shí)驗(yàn)室，昆明 650118；2. 長沙醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 應(yīng)用生物學(xué)教研室，長沙 410219）

基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移（Fluorescence energy resonance transfer，F(xiàn)RET）原理利用單壁碳納米管（Single-walled carbon nanotubes，SWCNTs）構(gòu)建一種操作簡單、成本低、靈敏度高和選擇性強(qiáng)的納米生物傳感器快速檢測(cè)含有tst基因金黃色葡萄球菌。將tst基因互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)為探針，利用單壁碳納米管聯(lián)合羧基熒光素（FAM）標(biāo)記的DNA分子探針（FAM-P）構(gòu)建出FAM-P/SWCNTs復(fù)合檢測(cè)體系。考察該體系對(duì)靶標(biāo)序列和靶標(biāo)菌的靈敏度和特異性。結(jié)果表明，該生物傳感器對(duì)靶標(biāo)序列的檢測(cè)下限低至10 nmol/L，并在10-100 nmol/L 范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系（R2= 0.994），對(duì)靶標(biāo)菌的檢測(cè)下限低至102，且在102-107CFU/mL范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2= 0.999）。此外，在錯(cuò)配實(shí)驗(yàn)和對(duì)非靶標(biāo)菌檢測(cè)時(shí)，該傳感器呈現(xiàn)了較高的特異性。本研究構(gòu)建的FAM-P/SWCNTs體系能快速檢測(cè)含tst基因金黃色葡萄球菌，并具有操作簡單、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，為食品檢測(cè)、臨床診斷等領(lǐng)域開辟了新途徑。

單壁碳納米管；熒光標(biāo)記的核酸探針；tst 基因；金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）分布極廣，主要存在于各類熟肉制品、乳及乳制品、蛋及蛋制品［1］，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染的致病菌［2］。金黃色葡萄球菌合成分泌的毒素和侵襲性酶類可引起食物中毒，如腸毒素、溶血毒素、毒性休克綜合征毒素（Toxic shock syndrom toxin-1，TSST-1）和脫氧核糖核酸酶等［3］。其中S.aureus 分泌的TSST-1能夠引起毒性休克綜合征（Toxic shock syndrome，TSS），并且可能使患者并發(fā)心內(nèi)膜炎與肌肉轉(zhuǎn)移性膿腫等疾病［4-5］。從患者體內(nèi)分離出的金黃色葡萄球菌中，高達(dá)70%的菌株都攜帶毒性休克綜合征毒素基因（tst）。TSST-1作為金黃色葡萄球菌重要的標(biāo)志性污染物之一，對(duì)其基因tst進(jìn)行檢測(cè)不僅可以用于微生物實(shí)驗(yàn)室致病菌株的篩選，也可用來研究金黃色葡萄球菌對(duì)機(jī)體的感染致病機(jī)制。

目前，可通過免疫學(xué)［6］、聚合酶鏈反應(yīng)［7］、及反向被動(dòng)乳膠凝集［8］等方法檢測(cè)含tst基因金黃色葡萄球菌，但是這些方法存在操作繁瑣、設(shè)備昂貴、靈敏度不高，特異性不強(qiáng)等缺點(diǎn)［9-12］。因此，建立一種更為穩(wěn)定、操作簡單、成本低廉、靈敏度和特異性高的方法來實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)TSST-1金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)顯得尤為重要。隨著材料科學(xué)的快速發(fā)展，納米材料被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域［13］，其中碳納米管具有生物低毒性，生物分子親和性等特點(diǎn)，在化學(xué)、材料學(xué)、生命科學(xué)及生物醫(yī)藥等領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用前景［14-15］。本研究利用單壁碳納米管（Single -walled carbon nanotubes，SWCNTs）聯(lián)合熒光標(biāo)記探針（FAM-P）作為復(fù)合檢測(cè)體系對(duì)含有tst基因的金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證該體系的靈敏度和特異性。

1 材料與方法

1.1 材料

稱取0.1g SWCNTs溶于100 mL 超純水，低溫條件下超聲波震蕩3 h使其均勻分散，制備成1 mg/mL SWCNTs儲(chǔ)備液，室溫保存。

菌種為金黃色葡萄球菌（S.aureus）、大腸桿菌K88（E.coli K88）、腸炎沙門氏菌（S.enteritidis）、志賀氏菌（S.castellani）均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所中心實(shí)驗(yàn)室提供。

LS55型熒光分光光度計(jì)（購自RerkinElmer公司）、PL203 型電子天平（購自于METTLER TOLEDO公司）、單壁碳納米管（購自于南京先鋒材料科技有限公司）。PBS 溶液（購自于SIGMA公司，pH7.4）高壓滅菌后4℃ 保存?zhèn)溆谩晒馓结槨袠?biāo)序列，靶標(biāo)的2個(gè)和12個(gè)堿基錯(cuò)配序列［16］（表1）均由上海生工生物科技有限公司合成。

表1 實(shí)驗(yàn)所需DNA序列

1.2 方法

1.2.1 FAM-P/SWCNTs反應(yīng)體系優(yōu)化 由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移受熒光供體和受體的比例影響很大，因此探討體系中FAM-P /SWCNs的最佳比例［8］：設(shè)定體系中 FAM-P 終濃度恒定為50 nmol/L，設(shè)置SWCNT終濃度分別0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09和1.0 mg/mL。設(shè)置激發(fā)波長為 480 nmol/L，發(fā)射波長 516 nmol/L，測(cè)定復(fù)合溶液熒光值（F）和原始熒光值（F0）。

1.2.2 靶標(biāo)和錯(cuò)配DNA序列的檢測(cè)試驗(yàn) 激發(fā)波長設(shè)置為 480 nmol/L，發(fā)射波長設(shè)置為 516 nmol/L；反應(yīng)體系中 FAM-P 終濃度恒定為50 nmol/Lol / L，加入最適宜濃度的SWCNT，制備成FAM-P/SWCNTs復(fù)合工作液；設(shè)置體系反應(yīng)中靶標(biāo)序列DNA濃度梯度 10、20、30、40、50、60、80和 100 nmol/L，另外兩種錯(cuò)配DNA序列只測(cè)定100 nmol/L的濃度，并設(shè)置空白對(duì)照以此來驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)體系的特異性程度，37℃恒溫孵育45 min。測(cè)定復(fù)合溶液熒光值（F）和原始熒光值（F0）。

1.2.3 S.aureus基因組中靶標(biāo)序列的檢測(cè)試驗(yàn) 使用涂布平板法在普通培養(yǎng)基上，37℃需氧條件下培養(yǎng)S.aureus 24 h后，制備成不同濃度的菌液：102、103、104、105、106和 107CFU/mL。95℃水浴 15 min 后置于冰上10 min得到菌體的單鏈DNA（ssDNA），將獲得的ssDNA加入最優(yōu)FAM-P /SWCNTs復(fù)合液中，孵育45 min后測(cè)定熒光值（F）。

1.2.4 FAM-P/SWCNTs 定量測(cè)定反應(yīng)體系準(zhǔn)確度驗(yàn)證 取102、104和106三種濃度的S.aureus樣品，按上述方法獲得ssDNA 并測(cè)定熒光值（F）后，對(duì)照樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線，以驗(yàn)證該反應(yīng)體系定量測(cè)定的準(zhǔn)確度。

1.2.5 菌種特異性檢測(cè) 為進(jìn)一步證明 FAM-P /SWCNTs復(fù)合檢測(cè)體系的特異性，故而選取大腸桿菌K88、腸炎沙門氏菌、志賀氏菌3種菌進(jìn)行檢測(cè)。以上3種菌分別制備成濃度為5×106CFU/mL的菌液，相同方法獲得ssDNA進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 FAM-P/SWCNTs復(fù)合反應(yīng)體系原理

本體系以SWCNTs為平臺(tái)，聯(lián)合熒光標(biāo)記的S.aureus 毒力島基因tst的互補(bǔ)鏈作為探針，基于SWCNT與DNA分子非共價(jià)偶聯(lián)后可淬滅熒光的特性，構(gòu)建 FAM-P /SWCNTs復(fù)合檢測(cè)體系（圖1）。當(dāng)體系中不存在靶標(biāo)序DNA時(shí)，F(xiàn)AM-P結(jié)合在SWCNT表面，此時(shí)探針上的FAM熒光基團(tuán)被淬滅。在靶標(biāo)DNA存在的情況下，F(xiàn)AM-P與靶序列互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈從SWCNT表面解離下來而恢復(fù)熒光。檢測(cè)體系中的靶標(biāo)序列的含量與熒光強(qiáng)度呈正相關(guān)，因此可以通過檢測(cè)體系中的熒光值實(shí)現(xiàn)對(duì)攜帶tst基因金黃色葡萄球菌的定量檢測(cè)。

圖1 FAM-P/SWCNTs復(fù)合反應(yīng)體系原理

2.2 FAM-P/SWCNTs反應(yīng)體系優(yōu)化

FAM-P/SWCNTs之間的比例是檢測(cè)體系的一個(gè)非常關(guān)鍵的因素，本實(shí)驗(yàn)通過8個(gè)不同比例的考察結(jié)果得到圖2。SWCNT濃度與熒光值的增加量呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)SWCNT濃度達(dá)到0.06 mg/mL 以上時(shí)熒光相對(duì)值F/ F0-1并無明顯變化并趨近與1.0。

圖2 FAM-P/SWCNTs比例優(yōu)化

2.3 靶標(biāo)和錯(cuò)配DNA序列的檢測(cè)試驗(yàn)

8個(gè)不同濃度的靶標(biāo)序列測(cè)定結(jié)果顯示：體系中的熒光值隨著靶標(biāo)序列濃度的增大而顯著增大，以靶標(biāo)DNA濃度為X軸，熒光值為Y軸，通過Origin8.0 軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：y = 2.414x + 11.90，R2= 0.994說明靶標(biāo)基因濃度在0.05-1.0 nmol/L范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，顯示出該體系的高靈敏度，見圖3。

在錯(cuò)配試驗(yàn)中，將未加入任何測(cè)定序列的試驗(yàn)作為空白對(duì)照，將同種濃度的靶標(biāo)序列與2種錯(cuò)配序列分別用相同體積的FAM-P/SWCNTs復(fù)合檢測(cè)體系中測(cè)定熒光值。結(jié)果（圖4）顯示加入靶標(biāo)序列后熒光值顯著增加，而2種錯(cuò)配堿基序列的實(shí)驗(yàn)經(jīng)過測(cè)定顯示的熒光值與空白組并無差異，說明FAMP/SWCNTs復(fù)合檢測(cè)體系的特異性很強(qiáng)。

2.4 S.aureus基因組中靶標(biāo)序列的檢測(cè)試驗(yàn)

金黃色葡萄球菌基因組DNA在單鏈狀態(tài)下，tst基因可與探針特異性結(jié)合并使探針脫離SWCNTs，從而恢復(fù)熒光。結(jié)果（圖5）顯示，隨著菌體濃度的上升熒光值顯著增大，在該濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（R2= 0.999）。

2.5 FAM-P/SWCNTs定量測(cè)定準(zhǔn)確度驗(yàn)證

為驗(yàn)證該反應(yīng)體系對(duì)于定量測(cè)定的準(zhǔn)確度，故選取102、104和106三個(gè)濃度的S.aureus樣品進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果（圖6）顯示，102、104和106三種濃度的S.aureus樣品熒光值測(cè)定后，對(duì)照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線，能夠得到相應(yīng)濃度，說明FAM-P/SWCNTs復(fù)合檢測(cè)體系對(duì)于含tst基因的S.aureus樣品定量測(cè)定具有較高的準(zhǔn)確度。

圖3 FAM-P/SWCNTs復(fù)合檢測(cè)體系對(duì)不同濃度靶標(biāo)序列的檢測(cè)

圖4 錯(cuò)配試驗(yàn)結(jié)果

2.6 菌種特異性檢測(cè)

選取大腸桿菌K88、腸炎沙門氏菌、志賀氏菌3種菌檢測(cè)該反應(yīng)體系的特異性，結(jié)果（圖7）顯示加入靶標(biāo)菌的熒光值顯著高于其它菌的熒光值，說明FAM-P/SWCNTs復(fù)合檢測(cè)體系有很強(qiáng)的特異性。

3 討論

圖5 含tst基因序列的S.aureus檢測(cè)結(jié)果

圖6 FAM-P/SWCNTs定量復(fù)合檢測(cè)體系準(zhǔn)確度檢測(cè)

圖7 FAM-P/SWCNTs復(fù)合檢測(cè)體系的特異性檢測(cè)

金黃色葡萄球菌是一種分布性極廣的食源性微生物污染源，存在于空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中，可以分泌多種致病的毒素和酶［17］。因?yàn)槠鋸V泛的分布性，食品極易受到污染，導(dǎo)致腐敗變質(zhì)，產(chǎn)生對(duì)人體有害的物質(zhì)，人類及其它動(dòng)物感染金黃色葡萄球菌可導(dǎo)致壞死性肺炎、乳房炎、食物中毒及毒性休克綜合征等。美國CDC報(bào)告指出，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。在美國由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒，占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，占到45%，中國金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件也時(shí)有發(fā)生。

在經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展的今天，人類更加重視食品安全，大力推動(dòng)對(duì)致病菌，如金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法的研究步伐。目前已有多種技術(shù)手段可對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行快速檢測(cè)。利用快速測(cè)試片法可依據(jù)微生物在測(cè)試片上的生長和顯色程度來判斷樣品中微生物的存在情況，這種方法操作步驟較為簡單，但在定量分析方面效果有所欠缺［18］；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是目前對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行快速檢測(cè)應(yīng)用最為廣泛的方法之一，將酶與特定的抗體耦聯(lián)，抗體與樣品中的靶標(biāo)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)后通過顯色反應(yīng)，利用酶標(biāo)儀對(duì)目標(biāo)微生物進(jìn)行定性或定量分析，ELISA檢測(cè)方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，但耗費(fèi)的成本也較高［19］；此外，快速發(fā)展的基因芯片技術(shù)也被用于微生物檢測(cè)領(lǐng)域，通過檢測(cè)雜交信號(hào)強(qiáng)弱可達(dá)到對(duì)目標(biāo)微生物的定性和定量檢測(cè)，但成本過高［20］。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷創(chuàng)新，不同學(xué)科之間相互借鑒，共同發(fā)展，將會(huì)產(chǎn)生更多的微生物快速檢測(cè)技術(shù)手段［21-22］。本實(shí)驗(yàn)利用單壁碳納米管聯(lián)合熒光素標(biāo)記探針構(gòu)建出操作簡便、成本低廉、靈敏度和特異性高的納米生物傳感器。根據(jù)熒光能量共振轉(zhuǎn)移原理，熒光標(biāo)記的探針與SWCNT非共價(jià)結(jié)合后兩種分子間距離＜10 nmol/L，此時(shí)即會(huì)發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移效應(yīng)使得熒光淬滅。當(dāng)在靶標(biāo)序列存在下，靶標(biāo)序列通過競(jìng)爭結(jié)合與探針序列堿基互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈，探針可從SWCNT表面解離下來，F(xiàn)AM基團(tuán)恢復(fù)熒光。隨著靶標(biāo)序列濃度升高，熒光值逐漸增強(qiáng)，可以通過檢測(cè)該復(fù)合體系的熒光值對(duì)含tst基因的金黃色葡萄球菌實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。該體系對(duì)靶標(biāo)序列濃度僅為0.05 μmol/L時(shí)仍能準(zhǔn)確的檢測(cè)出，說明其靈敏度較高；在錯(cuò)配試驗(yàn)和對(duì)不同菌液樣品的檢測(cè)結(jié)果也說明該體系的特異性較強(qiáng)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用單壁碳納米管聯(lián)合熒光標(biāo)記探針構(gòu)建出復(fù)合檢測(cè)體系對(duì)含tst基因的金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示該復(fù)合檢測(cè)體系靈敏度高，在靶標(biāo)序列濃度0.05-1.0 nmol/L和目標(biāo)菌液濃度102-107CFU/mL范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2= 0.994；R2= 0.999）；在錯(cuò)配試驗(yàn)和對(duì)不同菌液樣品的檢測(cè)結(jié)果也說明了該體系的特異性很強(qiáng)。

［1］Lu YX, Xiao TT, Song J, et al. Isolation, identification and contamination analysis of Staphylococcus aureus and coliforms in cold dishes and cooked meat products［J］. Chinese Journal of Health Laboratory Technology, 2015.

［2］Chen Y, Jin D, Lu SJ. Analysis of 12 cases of severe sepsis caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in children［J］. Journal of Clinical Pediatrics, 2015, 121（1-4）：55-73.

［3］ Fetsch A, Contzen M, Hartelt K, et al. Staphylococcus aureus foodpoisoning outbreak associated with the consumption of ice-cream［J］. International Journal of Food Microbiology, 2014, 187：1-6.

［4］Zaghloul MZ. Staphylococcus aureus toxic shock syndrome［J］.Tropical Medicine & Surgery, 2015, 3：2.

［5］Tinelli M, Monaco M, Maffezzini E, et al. Staphylococcus aureus toxic shock syndrome toxin-1 endocarditis with muscular metastatic abscesses［J］. New Microbiologica Official Journal of the Italian Society for Medical Virology, 2014, 37（37）：113-118.

［6］Bergdoll MS. Analytical methods for Staphylococcus aureus［J］IntJ Food Microbiol, 1990, 10：91-100.

［7］Da CML, Calsolari RA, Júnior JP. Detection of enterotoxin and toxic shock syndrome toxin 1 genes in Staphylococcus, with emphasis on coagulase-negative staphylococci［J］. Microbiology &Immunology, 2007, 51（4）：381-390.

［8］Igarashi H, Fujikawa H, Shingaki M, et al. Latex agglutination test for staphylococcal toxic shock syndrome toxin 1［J］. Journal of Clinical Microbiology, 1986, 23（3）：509-512.

［9］Mills JT, Dodel AW, Kass EH. Regulation of staphylococcal toxic shock syndrome toxin-1 and total exoprotein production by magnesium ion［J］. Infection & Immunity, 1986, 53（3）：663-670.

［10］Lee AC, Robbins RN, Reiser RF, et al. Isolation of specific and common antibodies to staphylococcal enterotoxins B, C1, and C2［J］. Infection & Immunity, 1980, 27（2）：431-434.

［11］Wieneke AA. Comparison of four kits for the detection of staphylococcal enterotoxin in foods from outbreaks of food poisoning［J］. International Journal of Food Microbiology, 1991,14（3-4）：305-312.

［12］Jarraud S, Peyrat MA, Lim A, et al. egc, a highly prevalent operon of enterotoxin gene, forms a putative nursery of superantigens in Staphylococcus aureus［J］. Journal of Immunology, 2001, 166（1）：669-667.

［13］賀氣志, 寧毅, 陳珂珂, 等. 基于核酸功能化的氧化石墨烯技術(shù)快速檢測(cè)含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌的研究［J］. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2016, 36（6）：453-457.

［14］Soleyman R, Hirbod S, Adeli M. Advances in the biomedical application of polymer-functionalized carbon nanotubes［J］.Biomater Sci, 2015, 3（5）：695-711.

［15］Battigelli A, Ménardmoyon C, Da RT, et al. Endowing carbon nanotubes with biological and biomedical properties by chemical modifications［J］. Advanced Drug Delivery Reviews, 2013, 65（15）：1899-1920.

［16］Deurenberg RH, Nieuwenhuis RF, Driessen C, et al. The prevalence of the Staphylococcus aureus tst gene among communityand hospital-acquired strains and isolates from Wegener’s Granulomatosis patients［J］. Fems Microbiology Letters, 2005,245（1）：185-189.

［17］Bronner S, Monteil H, Prévost G. Regulation of virulence determinants in Staphylococcus aureus：complexity and applications［J］. Fems Microbiology Reviews, 2004, 28（2）：183-200.

［18］ Silva BO, Caraviello DZ, Rodrigues AC, et al. Evaluation of Petrifilm for the isolation of Staphylococcus aureus from milk samples［J］. Journal of Dairy Science, 2005, 88（8）：3000-3008.

［19］Nguyen HM, Rocha MA, Chintalacharuvu KR, et al. Detection and quantification of Panton-Valentine leukocidin in Staphylococcus aureus cultures by ELISA and Western blotting：diethylpyrocarbonate inhibits binding of protein A to IgG［J］.Journal of Immunological Methods, 2010, 356（1-2）：1-5.

［20］Abeyrathne CD, Huynh DH, Mcintire TW, et al. Lab on a chip sensor for rapid detection and antibiotic resistance determination of Staphylococcus aureus［J］. Analyst, 2016, 141（6）：1922-1929.

［21］ Ashok AD, Maxime D, Jocelyn R, et al. Single-pair fluorescence resonance energy transfer on freely diffusing molecules：Observation of Forster distance dependence and subpopulations［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96（7）：3670-3675.

［22］Dyadyusha L, Yin H, Jaiswal S, et al. Quenching of CdSe quantum dot emission, a new approach for biosensing［J］. Chemical Communications, 2005, 25（25）：3201-3203.

A Nano Biosensor for Rapid Detecting Staphylococcus aureus Containing tst Gene

LI Ming-yang1HE Qi-zhi2MA Chun-xia1YU Jian-kun1
（1. Central Laboratory，Institute of Medical Biology，Chinese Academy of Medical Science ＆ Peking Union Medical College，Kunming 650118；2.Department of Applied Biology，School of Basic Medical Science，Changsha Medical University，Changsha 410219）

This work is to construct a nano biosensor of simple operation，low cost，high sensitivity and specificity to rapid detect Staphylococcus aureus containing tst gene with single-walled carbon nanotubes（SWCNTs）based on the principle of fluorescence energy resonance transfer（FRET）. SWCNTs combined with carboxyfluorescein（FAM）-labeled DNA molecule probes（FAM-P）were used to construct FAM-P/SWCNTs composite detection system，and the probe was complementary molecular sequence of tst gene. The sensitivity and specificity of the system to the target sequence and the target strain were investigated. As results，the lower detection limit of target sequence was 10 nmol/L and presented a fine linear relationship（R2was 0.994）in the range of 10-100 nmol/L. The detection limit of the target strain was as low as 102and in the range of 102-107CFU/mL（R2was 0.999）. In addition，the sensor exhibited a high specificity in mismatch experiments and for non-target bacteria detection. In conclusion，the composite detection system by FAM-P/SWCNTs has the advantages of rapid detection，simple operation，high sensitivity and strong specificity，which opens up a new approach for food detection and clinical diagnosis.

single-walled carbon nanotubes；carboxyfluorescein-labeled nucleic acid probes；tst gene；Staphylococcus aureus

2017-04-12

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目（20111106120056）

李明陽，男，碩士研究生，研究方向：RNA甲基化；E-mail：403124921@qq.com；賀氣志，女，碩士研究生，研究方向：生物傳感器技術(shù)及致病菌的耐藥干預(yù)；E-mail：314190831@qq.com，賀氣志為共同第一作者

俞建昆，男，博士，研究方向：癌癥相關(guān)pre-mRNA選擇性剪接變化與調(diào)節(jié)機(jī)制；E-mail：yjk@imbcams.com.cn

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0291

（責(zé)任編輯 朱琳峰）