水稻Bph14基因生理功能初探

李三和 閘雯俊 陳志軍 周雷 劉凱 游艾青

（1. 湖北省農業科學院糧食作物研究所，糧食作物種質創新與遺傳改良湖北省重點實驗室，武漢 430064；2. 主要糧食作物產業化湖北省協同創新中心（長江大學），荊州 434025）

水稻Bph14基因生理功能初探

李三和1，2閘雯俊1陳志軍1，2周雷1劉凱1，2游艾青1，2

（1. 湖北省農業科學院糧食作物研究所，糧食作物種質創新與遺傳改良湖北省重點實驗室，武漢 430064；2. 主要糧食作物產業化湖北省協同創新中心（長江大學），荊州 434025）

Bph14 基因是第一個被克隆的水稻抗蟲基因，但鮮有Bph14基因對水稻生理方面影響的報道。研究該基因對水稻生理方面的影響有助于全面理解Bph14基因對褐飛虱的抗性機制。將Bph14基因轉入水稻栽培品種中，對攜帶有外源基因的轉基因株系通過熒光定量PCR檢測乙烯合成和非生物脅迫相關基因的表達，另外，分別用5 μmol/L ABA和250 mmol/L NaCl處理轉基因水稻株系和相應受體材料，結果表明，與乙烯合成相關的基因OsACO2，OsACS2，OsACS6，O1gP5CS 和 O5gP5CS 的表達量均較轉基因受體m5274發生了變化，與干旱、耐鹽等非生物脅迫相關的基因CatA、CatB、CatC、RAB16A、LEA3、LIP9、SalT、AdhI等也都不同于在受體m5274中的表達。同時Bph14基因的導入也提高了水稻對ABA的敏感性和對鹽脅迫的耐受性，說明Bph14基因在水稻中可能參與調控乙烯合成以及非生物脅迫應答的功能基因的表達。

Bph14基因；乙烯合成；非生物脅迫；水稻

水稻是世界上最主要的糧食作物。為確保全球日益增長的人口的糧食安全，控制各種蟲害對水稻的危害尤為必要［1］，而褐飛虱是對水稻生產破壞性最強的蟲害。1969年第一次報道Mudgo是褐飛虱的宿主抗性水稻品種［2］。大多數研究表明抗性水稻品種抑制了褐飛虱的體重，大面積的水稻生產區域中褐飛虱的數量多代維持在一個較低的水平［3，4］，抗性品種的產量也明顯比易感品種高［5］。因此，控制褐飛虱最經濟和對環境最友好的策略是種植具有遺傳抗性的水稻品種［6］。

自20世紀70年代起，各國相繼開展了水稻褐飛虱抗性基因的發掘工作。截至2017年4月，經國際注冊確認和報道的水稻抗褐飛虱基因共31個，已被定位的達26個，已經克隆的有3個：Bph14、Bph9 和 Bph3［7-9］。Bph14 基 因 來 源 于 水 稻 材 料B5［10-11］，是第一個被克隆的水稻抗蟲基因。它在不同遺傳背景下表現出穩定的抗性，對發展抗性水稻品種很有意義。

早期研究發現，乙烯幾乎參與調控了植物生長發育的全部過程，同時，乙烯在植物響應逆境脅迫的過程中也具有重要的作用，植物遭受脅迫時產生乙烯，在植物對逆境脅迫的感受和適應中通過啟動和調節某些與逆境適應相關的生理生化過程來誘導抗逆性的形成。如植物在干旱、高鹽、低溫和病害等逆境脅迫中都有乙烯的不同程度的參與，且具有各自的脅迫應答機制。ACO、ACS、P5CS等基因在植物體內的作用都與乙烯合成途徑和抗性有關。ACO（1-氨基環丙烷-1-羧酸氧化酶）是乙烯生物合成途徑中的最后一個酶，催化ACC（1-氨基環丙烷-1-羧酸）向乙烯轉化。ACS則是ACC合成酶，是乙烯合成途徑中的關鍵酶和限速酶。水稻基因組中有6個ACO基因和6個ACS基因，這些基因都能影響乙烯的合成，也進一步影響植物的抗逆性。P5CS（二氫吡咯-5-羧酸合成酶）是植物體內合成脯氨酸的關鍵酶，受干旱、高溫和ABA誘導。已在豇豆、煙草、擬南芥、柑橘、馬鈴薯等多種作物中轉化P5CS基因，可導致植物體內脯氨酸增加，從而使其耐鹽性［12-13］和抗旱性［14-15］增強。

過氧化氫酶（CAT）是植物體內主要的抗氧化酶之一，能通過清除細胞內積累的H2O2來增強植株的耐鹽性［16］。水稻數據庫（http://rice. plantbiology.msu.edu/）中顯示水稻基因組中有3個過氧化氫酶基因：CatA基因、CatB基因和CatC基因。

LEA3、LIP9和RABl6A都是依賴于ABA信號通路中的標記基因。這3個基因都能被ABA誘導表達且在它們的啟動區都有ABA應答元件（ABRE）［17］。RAB16A 是水稻脫落酸應答基因。有研究表明，當脫落酸濃度由1 μmol/L增加到12 μmol/L時，水稻根中Os RAB16A的表達量也隨之增加［18，19］。晚期胚胎富集蛋白（LEA）是一類親水性蛋白，在高鹽、干旱、低溫等非生物脅迫的刺激下產生，能維持細胞膜完整性及細胞內酶的活性，降低細胞受損程度［20，21］。LEA3基因能增強植物對高鹽、干旱的耐受性。Duan等［20］提出OsLEA3-1或OsLEA3-2的過表達水稻對增強耐旱能力有促進作用。

高等植物醇脫氫酶ADH基因家族中，家族成員在防御生物和非生物脅迫中起作用，并且還是很多激素作用途徑中的參與者［22-24］。ADH基因表達產物醇脫氫酶在淹水、干旱、鹽、冷害脅迫以及對機械損傷及信號分子的響應中都具有非常積極的作用［25］。

ABA 在調控植物生長發育中具有十分重要的作用，其更多的是通過與其他植物激素的相互作用，特別是植物激素乙烯。同時，在植物中，ABA 作為一種抗逆激素已經得到廣泛認可，它能夠在多種逆境脅迫反應中發揮調控作用，降低包括干旱、高鹽等逆境脅迫對植物的損傷，這些方面的研究已有大量文獻報道［26-29］。

本研究通過農桿菌介導的方法將Bph14基因轉入主栽水稻品種，在研究確定外源Bph14基因能夠穩定遺傳的前提下，分析轉基因水稻中乙烯合成相關基因和非生物脅迫相關基因的表達情況以及轉基因水稻對外源ABA的敏感性和對鹽的耐受性，得到Bph14基因在轉基因水稻中的生理影響的初步結果，以期全面理解Bph14基因對褐飛虱的抗性機制。

1 材料與方法

1.1 材料

轉基因受體材料m5274為湖北省農業科學院糧食作物研究所自有秈稻品種，代號為F；水稻品種B5由武漢大學何光存實驗室提供。轉化用農桿菌為EHA105，目的基因Bph14代號為5，轉基因后代編號記為F5。轉化載體見圖1。

1.2 方法

1.2.1 PCR檢測目的基因的整合 用CTAB法提取轉基因后代植株葉片DNA，進行PCR檢測目的基因的整合情況。PCR程序為：95℃預變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，32個循環；72℃延伸10min，4℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。PCR檢測Bph14基因的引物 為：5'-ATAGACCAGAAGCTATTCGGACTCC-3'；5'-AAGTCGACGGAGAGATAAACAACG-3'。

圖1 轉化載體T-DNA區圖譜

1.2.2 Q-PCR檢測基因表達 水稻幼苗總RNA 用TRIzol法抽提，然后用DNase 去除殘留的基因組DNA，cDNA第一鏈用2 μg總RNA 作模版，通過M-MLV反轉錄酶合成。使用Bio-Rad IQ5系統進行Real-time PCR擴增，用SYBR 監測生成雙鏈DNA 的量，用Actin作為反應的內參。所用引物見表1。

表1 qPCR引物序列

1.2.3 ABA 處理試驗 水稻種子25℃條件下16 h光 8 h 暗萌芽至第4天，根長約0.3 cm 時，將幼苗平分為兩組，分別轉移至不含ABA 和ABA濃度為5 μmol/L 的1/10 MS培養液中培養3 d，觀察根和幼苗的生長狀況。

1.2.4 鹽脅迫試驗 水稻種子分為兩組，一組用清水，另一組用濃度為250 mmol/L的 NaCl水溶液浸種2 d，在30℃培養箱中16 h 光/8 h 暗發芽。然后將用清水發芽的一組轉入1/10 MS培養液中，另一組轉入含有250 mmol/L NaCl 的1/10 MS培養液中繼續培養3 d，觀察根和幼苗的生長狀況。

2 結果

2.1 目的基因的整合與表達

提取轉化得到的再生植株T1代葉片DNA，通過PCR檢測目的基因Bph14整合情況，絕大多數植株都能檢測到566 bp大小的條帶，少數植株在后代分離過程中丟失了目的基因（圖2）。

通過Q-PCR檢測目的基因Bph14的表達情況，除野生型對照外，其余含有目的基因的轉基因植株都能檢測到Bph14的表達，擴增片段長度為284 bp（圖 3）。

2.2 乙烯合成及非生物脅迫應答功能基因的表達

通過對廣泛存在于植物中的乙烯合成和非生物脅迫應答功能相關基因的表達進行檢測，轉基因植株中，OsACO2、OsACS2、OsACS6等與乙烯合成相關的基因表達發生了不同程度的變化，檢測其它一些與逆境脅迫相關的基因，也出現了不同植株中不同基因表達量不同的情況。所有這些被檢測的基因中，轉基因后代植株大都出現了表達量的變化，有的變化不是很明顯，有的則出現成倍增長或降低的情況（圖4）。這些結果的出現表明，Bph14基因可能參與調控乙烯合成以及非生物脅迫應答的功能基因的表達。

2.3 ABA處理試驗

從處理組和未處理組的實驗結果（圖5）對比可以看出，轉Bph14基因水稻芽和根的生長明顯受到ABA的抑制，芽的長度顯著變小，根的數量減少，長度也明顯變小，而未轉基因的受體材料處理與否影響較小。說明Bph14基因的導入提高了水稻對外源ABA的敏感性。

圖2 部分轉基因植株T1代Bph14基因PCR檢測

圖3 Bph14轉基因T1植株的RT-PCR分析

2.4 鹽脅迫試驗

經過250 mmol/L NaCl處理的轉基因幼苗長度較對照材料（受體）長，有的甚至顯著增長，而未經處理的一組受體材料和轉基因材料幼苗生長長度沒有明顯差異（圖6）。這說明Bph14基因的導入提高了水稻對鹽脅迫的耐受性。

3 討論

稻在引入外源抗性基因后的一些生理變化，以期再經過深入研究后能解析出水稻抗蟲性與其他非生物脅迫抗性之間的關系。本研究針對外源基因穩定表

圖4 乙烯合成及非生物脅迫應答功能基因的表達

Bph14基因是水稻中克隆的第一個抗褐飛虱基因，該基因的克隆意義重大。水稻轉基因的研究文獻報道較多，但目前鮮有抗蟲基因Bph14對植物乙烯合成和抗逆性影響方面的報道。杜波等［7］的研究表明褐飛虱取食轉Bph14基因水稻后激活了植物防御昆蟲取食的水楊酸信號，相關基因表達量上調，但該研究沒有研究取食前轉基因植株與受體植株相比在生理上的一些變化。本研究則考慮初步探索水達的轉基因后代株系進行乙烯合成相關基因和部分非生物脅迫相關基因的表達研究，并對轉Bph14基因水稻在生理上的一些反應作了初步探索，發現轉基因后代株系中，乙烯合成相關基因和非生物脅迫相關基因的表達都發生了明顯的變化，且通過外源ABA敏感試驗和鹽脅迫試驗也能看出，由于Bph14基因的導入，水稻增強了對外源ABA的敏感性以及對鹽的耐受性。這些實驗結果表明，來源于水稻B5的Bph14基因在水稻中可能參與調控乙烯合成以及非生物脅迫應答的功能基因的表達。對于植物而言，乙烯合成和ABA對植物的影響以及干旱、耐鹽性等生理活動有一個龐大的網絡聯系，各個因素之間都不是獨立存在的，而是相互影響，相互制約。轉 Bph14基因水稻在生理上的這些變化由Bph14基因引起，但具體機制還有待于進一步研究，這些機制可能有助于全面理解Bph14基因對褐飛虱的抗性機理。

圖5 Bph14提高水稻對ABA的敏感性

圖6 Bph14提高水稻對鹽脅迫的耐受性

4 結論

本研究將Bph14基因轉入水稻栽培品種m7274中，攜帶有外源基因的轉基因株系中目的基因都能表達。通過熒光定量PCR檢測表明，與乙烯合成相關的基因OsACO2，OsACS2，OsACS6，O1gP5CS和 O5gP5CS 等的表達量均較轉基因受體m5274發生了變化，與干旱、耐鹽等非生物脅迫相關的基因CatA、CatB、CatC、RAB16A、LEA3、LIP9、SalT、AdhI等也均不同于在受體m5274中的表達。分別用5 μmol/L ABA和250 mmol/L NaCl處理轉基因水稻株系和相應受體材料發現，Bph14基因的導入提高了水稻對ABA的敏感性和對鹽脅迫的耐受性，說明Bph14基因在水稻中可能參與調控乙烯合成以及非生物脅迫應答的功能基因的表達。

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Preliminary Study on Physiological Function of Gene Bph14 in Rice

LI San-he1，2ZHA Wen-jun1CHEN Zhi-jun1，2ZHOU Lei1LIU Kai1，2YOU Ai-qing1，2
（1. Food Crops Institute，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Hubei Key Laboratory of Food Crop Germplasms and Genetic Improvement，Wuhan 430064 ；2. Hubei Collaborative Innovation Center for Grain Industry，Yangtze University，Jingzhou 434025）

Gene Bph14 is the first cloned rice insect-resistant gene，however，there were few reports about the effects of Bph14 gene on rice physiology. The study of the physiological effects of the gene on rice would contributes to a comprehensive understanding of the resistance mechanism of gene Bph14 to brown planthopper. The gene Bph14 was transferred into rice cultivar m5274，and genes related to ethylene biosynthesis and abiotic stress response were detected by Q-PCR in transgenic lines carrying gene Bph14. In addition，transgenic lines and the accepter line were treated with 5 μmol/L ABA and 250 mmol/L NaCl respectively. In these lines，OsACO2，OsACS2，OsACS6，O1gP5CS，and O5gP5CS expressed differently from those in m5274. Genes such as CatA，CatB，CatC，RAB16A，LEA3，LIP9，SalT，and AdhI related to abiotic stress of drought and salt-resistance also differently expressed from those in m5274. At the same time，the introduction of Bph14 gene improved the sensitivity of rice to ABA and the resistance to salt stress. These results indicate that gene Bph14 in rice probably participates in the regulation of ethylene biosynthesis and expression of functional genes in abiotic stress response.

Bph14 gene；ethylene biosynthesis；abiotic stress；rice

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0754

2017-09-11

國家轉基因重大專項（2014ZX0800101B），國家科技支撐計劃（2015BAD01B01）

李三和，女，博士，研究方向：水稻轉基因研究；E-mail：lisanhe1@163.com

游艾青，男，博士，研究方向：水稻遺傳育種；E-mail：aq_you@163.com

（責任編輯 朱琳峰）