靈芝多糖的提取及結構研究

王俊

摘要 為提取、分離純化靈芝多糖及探究靈芝多糖的結構，采用熱水浸提法提取出靈芝粗多糖、醇沉法除去蛋白質、DEAE-52纖維素離子交換柱法和超純水透析純化得到靈芝純多糖，并利用核磁共振氫譜（1H NMR）對靈芝多糖的結構進行檢測。結果表明，在δ 4.94、4.87和4.40為3個異頭氫信號，說明該多糖是由3種單糖組成；δ 4.94和4.87歸屬為β構型的單糖，δ 4.40歸屬為α構型的單糖，表明該多糖是由2種β構型和1種α構型的單糖所組成。

關鍵詞 靈芝多糖；提取；純化；結構

中圖分類號 O657.3；TS207.3 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）17-0255-01

Abstract To extract，separate and purify Ganoderma polysaccharide and to explore its structure，this experiment used hot water extraction method to extract the Ganoderma polysaccharide，used alcohol sinking method to remove protein，and used DEAE-52 cellulose ion exchange column method to get polysaccharide purified，and used nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum（1H NMR）to identify the structure of Ganoderma polysaccharide.The results showed that the polysaccharides were composed of 3 kinds of monosaccharides，which were composed of 3 different hydrogen signals in δ 4.94，4.87 and 4.40.The δ 4.94 and 4.87 belonged to monosaccharides of β configuration，and δ 4.40 belonged to monosaccharides of α configuration，which meaned that the polysaccharides were composed of 1 monosaccharide of α configuration and 2 wemonosaccharides of β configuration.

Key words Ganoderma polysaccharide；extraction；purification；structure

藥用真菌是中草藥的重要組成部分，一些傳統藥用真菌如靈芝、蟲草等，在中國傳統醫藥中起著重要的作用，長期以來一直用于預防和治療各種人類疾病[1]。藥用真菌資源豐富，在我國的分布十分廣泛，其科學研究也具有重要的意義[2]。

靈芝（Ganoderma Lucidum Karst）是一種名貴的中藥真菌。靈芝多糖是從靈芝子實體中提取的一種化學成分，靈芝多糖是靈芝中的一種重要活性物質，具有免疫調節、抗腫瘤、抗衰老和抗氧化等多種生物活性，目前已成為一大研究熱點，具有廣闊的開發利用前景[3-4]。本研究以靈芝子實體為材料，采用熱水浸提法和 DEAE-52離子交換柱層析法分離純化獲得了靈芝純多糖，并利用核磁共振氫譜（1H NMR）對靈芝多糖的結構進行了檢測，為靈芝多糖的提取和結構分析提供基本依據，也為之后研究靈芝多糖對免疫細胞的活性、免疫機制及相關分子生物學機制奠定了科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗所用的靈芝由西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室提供；無水乙醇（成都市聯合化工試劑研究所）；氫氧化鈉、氯化鈉、濃鹽酸、濃硫酸（成都市科龍化工試劑廠）；DEAE-52纖維素（上海源葉生物科技有限公司）；透析袋（7 kDa）（BioSharp生物科技公司）。

1.2 儀器與設備

臺式離心機（5424R）Eppendorf（德國）；落地式大容量冷凍離心機（Lynx 6000）Thermo（美國）；旋轉蒸發器（RE-6000）、循環水真空泵（SHZ-Ⅲ）（上海亞榮生化儀器廠）；超純水儀（Spring-R40i+）（銳思捷科學儀器有限公司）；粉碎機（HX-500A）（浙江省永康市溪岸五金藥具廠）；電子天平（AR2130）[奧豪斯儀器（上海）有限公司]；電熱恒溫水浴鍋（WBK-3B）（廣東環凱微生物科技有限公司）；恒溫干燥箱（101-3Y）（杭州藍天化驗儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 熱水浸提法提取靈芝粗多糖。稱取靈芝子實體130 g，65 ℃烘箱烘干后，置于粉碎機內粉碎。將粉碎后的靈芝粉倒入燒杯中加入超純水混勻，置于90 ℃恒溫水浴鍋內水浴加熱6 h。蒸煮完成后將混合液10 000 r/min離心30 min，收集沉淀按上述步驟重復2次；收集上清液置于旋轉蒸發儀中濃縮。

1.3.2 醇沉法除去蛋白質。以3∶1的比例加入無水乙醇和濃縮液，醇沉1～2 d，10 000 r/min離心20 min，收集醇沉物，置于65 ℃烘箱內烘干待用；收集上清液進行旋轉濃縮，置于65 ℃烘箱內烘干，即為靈芝寡聚糖，用于后續試驗。超純水溶解烘干后的醇沉物，10 000 r/min離心20 min，收集上清液，得到靈芝粗多糖。

1.3.3 DEAE-52纖維素離子交換柱法純化靈芝粗多糖。稱取50 g纖維素，超純水浸泡混勻，棄上清。0.5 mol/L NaOH溶液浸泡12 h，超純水洗滌至中性，0.5 mol/L HCl溶液浸泡12 h，超純水洗滌至中性，0.5 mol/L NaOH溶液浸泡12 h，超純水洗滌至中性，即完成了纖維素的活化。將活化好的纖維素沿著玻璃棒輕輕地倒入層析柱內，使纖維素在柱內自然沉降，并用超純水壓柱待用。

沿管壁輕輕地旋轉加入靈芝粗多糖稀釋液，向層析柱中加入超純水，并收集過柱液，直至多糖完全洗脫。收集完成后，將收集的過柱液進行旋轉濃縮，超純水透析48 h，以10 000 r/min離心20 min。取上清，置于65 ℃烘箱內烘干，即為靈芝純多糖。并用0.5 mol/L NaCl溶液洗脫色素，再用超純水過柱。將纖維素從層析柱中倒出，按照維素活化的步驟再次活化纖維素，重復上述步驟直至獲得足夠量的靈芝純多糖。

1.3.4 1H NMR測定靈芝多糖結構。取靈芝純多糖溶于D2O中，在工作頻率為59.75 MHz的FT-NMR波中進行1H NMR測定。

2 結果與分析

1H NMR中化學位移（δ）是通過出現不同位置的1H核磁共振信號確定所含氫基團類型。由圖1可知，在δ 4.94、4.87和4.40為3個異頭氫信號，說明該多糖是由3種單糖組成。δ 4.94和4.87可歸屬為β構型的單糖，而δ 4.40可歸屬為α構型的單糖，表明該多糖是由2種β構型和1種α構型的單糖所組成的多糖。在δ 3.14～4.08為多個質子的多重吸收峰，是第2～6位碳上的氫信號峰。

3 結論

近年來，國內外對靈芝多糖的提取、純化及結構分析和生物活性等方面進行了大量的研究。何晉浙等[5-6]從靈芝子實體中提取得到靈芝多糖，并結合UV-VIS、IR、GC-MS和NMR法對靈芝多糖的結構進行解析，得到該靈芝多糖的主要單糖組分為葡萄糖，主要構型特征是以（1→3）β-D線性連接的骨架結構。Zeng Tao等[7]從靈芝中分離提取了靈芝多糖（GLPS），并研究了GLPS在腫瘤治療中的作用機制。結果表明，GLPS通過免疫調節、抗血管生成和細胞毒性介導抗腫瘤作用，從而抑制腫瘤發生或腫瘤生長。張志軍等[8]對靈芝多糖進行了體外抗氧化活性研究，結果表明，靈芝多糖具有抗氧化作用和清除自由基的能力，對免疫功能疾病具有很好的預防作用。

本研究采用熱水提取法從靈芝子實體中提取多糖，采取醇沉的方法浸提濃縮液除去蛋白質，通過DEAE-52纖維素離子交換柱純化多糖，并使用超純水透析去除寡聚糖、氨基酸等小分子物質，最后得到質量良好的靈芝多糖，并利用核磁共振氫譜（1H NMR）對靈芝多糖的結構進行檢測，可以推測出該多糖是由3種單糖組成，并且是由2種β構型和1種α構型的單糖類型所組成。綜上所述，本研究可以為靈芝多糖的提取純化奠定理論基礎，為靈芝多糖的結構解析提供科學依據。關于結合其他結構鑒定方法對靈芝多糖的結構特征分析還有待于進一步研究，對靈芝多糖的生物學活性及相關分子機制也有待于下一步探究。

4 參考文獻

[1] 陶文沂.藥食用真菌研究技術[M].北京：化學工業出版社，2007：1.

[2] 張靜潮，李榮春.中國藥用真菌研究概述[J].安徽農業科學，2014，42（18）：6118-6120.

[3] 吉清妹，潘孝忠，符傳良，等.野生靈芝與栽培靈芝主要成分和功效的比較分析[J].熱帶農業科學，2015，35（12）：80-83.

[4] 向俊宇，徐安，夏懋，等.靈芝多糖的研究進展[J].藥學實踐雜志，2010，28（4）：241-244.

[5] 何晉浙，邵平，孟祥河，等.靈芝多糖的結構特征分析[J].分析化學，2010，38（3）：372-376.

[6] 何晉浙，邵平，倪慧東，等.靈芝多糖結構及其組成研究[J].光譜學與光譜分析，2010，30（1）：123-127.

[7] ZENG Tao，XU Xiuping，CHEN Zhangfeng，et al.Ganoderma lucidum po-lysaccharides：immunomodulation and potential anti-tumor activities[J].The American Journal of Chinese Medicine，2011，39（1）：15-27.

[8] 張志軍，李淑芳，魏雪生，等.靈芝多糖體外抗氧化活性的研究[J].化學與生物工程，2011，28（3）：63-65.