固相萃取—高效液相色譜法測定烤煙中角鯊烯含量

董麗紅+韋建玉+胡亞杰+陳澤鵬+張功營+萬樹青

摘要：通過優化提取劑、提取方法、凈化劑等前處理方法和色譜條件，建立了烤煙中角鯊烯含量測定的SPE-HPLC方法。烤煙樣品用三氯甲烷超聲提取40 min，硅膠柱凈化，高效液相色譜儀[檢測波長：210 nm；流動相：甲醇/乙腈=75/25（V/V）]檢測，可以準確地測定烤煙中角鯊烯含量；角鯊烯濃度在0.5～10 mg/L 范圍內線性關系良好（r=0.9976）。方法的檢出限（S/N=3）為 0.12 mg/L，定量限（S/N=10）為 0.39 mg/L，平均加標回收率為 88.12%。利用該方法對5個不同地區的同品種烤煙中角鯊烯含量進行測定的結果表明，不同地區的烤煙中角鯊烯含量有所差異。該方法準確度高、重現性好，可用于烤煙中角鯊烯的含量測定。

關鍵詞：烤煙；角鯊烯；固相萃取；高效液相色譜儀

中圖分類號：S572文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）12-0130-05

Abstract A SPE-HPLC method to determinate squalene in flue-cured tobacco was established by optimizing the chromatographic conditions and pretreatment method （extractant， extraction method and purification agent）. After validation， the method was used to measure the squalene in flue-cured tobacco from five different areas. Flue-cured tobacco samples were extracted by trichloromethane for 40 minutes and purified with the silica gel column. And the squalene content in samples was detected by the high performance liquid chromatograph （detection wavelength： 210 nm； mobile phase： methanol/acetonitrile = 75/25（V/V））. The squalene concentration showed a good linear relationship in the range of 0.5～10 mg/L （r=0.9976）. The limit of detection （LOD） and the limit of quantification （LOQ） of established method were 0.12 mg/L and 0.39 mg/L， respectively. The average recovery was 88.12% at three spiked levels. The results showed that the squalene content in flue-cured tobacco from different areas was different. The established SPE-HPLC method had high accuracy and good reproducibility， which could be used for the determination of squalene in flue-cured tobacco.

Keywords Flue-cured tobacco； Squalene；Solid phase extraction； High performance liquid chromatograph

角鯊烯是一種高度不飽和的直鏈三萜類化合物，具有提高血紅蛋白的攜氧能力，促進新陳代謝，提高體內超氧化物歧化酶（SOD）活性、增強機體免疫能力、抗腫瘤等多種生理功能，是一種具有防病治病作用的生物活性物質[1-3]。角鯊烯不僅存在動物體內，在植物中的分布也十分廣泛，橄欖油和棕櫚油中含有較豐富的角鯊烯，但其它植物中也有角鯊烯的存在，如鼠尾草、蕨類植物、綠色藻類植物、苔蘚植物及煙葉等[4-8]。

卷煙煙氣中含有多種有害化合物，其中自由基具有特殊的化學結構，性質較活潑，可以參與人體的多種生化反應，誘發多種疾病，對人體危害較大[9-14]。目前，清除卷煙煙氣自由基的主要方法是向煙絲和濾嘴中加入自由基清除劑，研究發現向卷煙中添加角鯊烯、番茄紅素、銀杏葉提取物、丁香酚、類胡蘿卜素等對卷煙煙氣中的自由基均有明顯的清除作用，其中角鯊烯對卷煙主流煙氣中自由基的清除率為35.4%～35.9%，但因技術或成本等原因真正應用到實際生產的較少[15-20]。因此，篩選和培育出含有角鯊烯的煙草品種對卷煙煙氣中自由基的降低具有重要意義。

目前，角鯊烯的檢測方法較多，如高效液相色譜法（HPLC）[21]、氣相色譜法（GC）[22，23]、氣相色譜-質譜聯用法（GC/MS）[24]、液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS）[25]，但應用到烤煙中角鯊烯的檢測方法未見報道。因此，本研究擬建立烤煙中角鯊烯的固相萃取-高效液相色譜法，并利用該方法測定不同地區烤煙中角鯊烯的含量，以期為進一步篩選和培育含角鯊烯的煙草品種提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

烤煙（廣西中煙工業有限責任公司提供）；角鯊烯對照品（純度≥99.8%，中國藥檢所）；甲醇、乙腈（色譜級）；三氯甲烷、正己烷、石油醚、丙酮（分析級）；凈化劑：PSA凈化柱，硅膠凈化柱（Welchrom公司）；0.22 μm有機微孔濾膜。endprint

高效液相色譜儀（配紫外檢測器，Agilent1100，美國Agilent公司）；臺秤：T-10000型，d=0.1 g[美國雙杰兄弟（集團）有限公司]；電子天平：BSA224S型，d=0.1 mg[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；旋轉真空蒸發器：RE52-99型（上海亞榮生化儀器廠）；真空抽濾泵：SHZ-DⅢ型（河南省鞏義市予華儀器有限公司）；超聲波清洗器：KQ-500型（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；恒溫水浴鍋：501數顯型（江蘇省金壇市宏華儀器廠）；粉粹機：750T（浙江省永康市鉑歐五金廠）；孔徑0.45 mm（40目）篩網。

1.2 烤煙樣品前處理方法

用粉碎機將烤煙樣品粉碎，過40目篩網。取試樣1.0 g 于50 mL具塞錐形瓶中，精確至0.1 g，向其中加入30 mL三氯甲烷，蓋上塞子，超聲提取40 min，抽濾，準確移取提取液12 mL旋轉蒸發至近干，用12 mL正己烷充分溶解，得正己烷提取液。用10 mL正己烷對固相硅膠凈化柱進行預淋洗后，將正己烷提取液緩慢加入，用10 mL正己烷洗脫，將洗脫液一并收集并旋轉蒸發至近干，用2 mL乙腈溶解，過0.22 μm有機微孔濾膜，得樣液。如需存放，應在4℃冰箱密封保存，并在3 d內測定。

1.3 色譜分析條件

Agilent SB-C18色譜柱（5 μm， 4.6 mm×250 mm），流動相為甲醇/乙腈（V/V）=75/25， 流速為1.0 mL/min， 柱溫為30℃，紫外檢測器檢測波長為210 nm，進樣量為10 μL。

1.4 標準溶液配制

1.4.1 標準儲備液 準確稱取0.10 g角鯊烯標準品，精確至0.01 g，用乙腈溶解并定容至100 mL棕色容量瓶，充分振蕩溶解，配制成1 000 mg/L的角鯊烯標準母液。該標準儲備液應在4℃以下保存，于72 h內使用。

1.4.2 系列標準工作溶液 準確移取5 mL標準儲備液至100 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成標準溶液；分別準確移取0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL標準溶液至50 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容。該系列標準工作溶液濃度依次為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L，現用現配。

1.5 檢出限與定量限

分別稱取等質量的烤煙樣品，向樣品中依次加入不同質量濃度的角鯊烯標準工作液，以加入等質量的乙腈為本底樣品對照組。按“1.2”的方法進行處理，檢測后取信噪比 S/N = 3 對應的樣品濃度為方法檢出限（LOD），信噪比S/N =10 對應的樣品濃度為方法定量限（LOQ）。

1.6 回收率與精密度

分別稱取等質量的烤煙樣品，向樣品中分別添加 3個濃度水平的角鯊烯標準液，以加入等質量的乙腈為本底樣品對照組。按“1.2”的方法進行處理，每個濃度連續重復5 次，計算回收率和變異系數。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

角鯊烯為不飽和烴類，易溶于正己烷、石油醚、丙酮和三氯甲烷等有機溶劑中，試驗中選擇這四種溶劑作為提取劑分別對烤煙樣品中角鯊烯進行提取。結果（圖1）表明，以三氯甲烷為提取劑對烤煙樣品中角鯊烯提取率最高，這與李冬梅等[26]不同提取方法對茶油中角鯊烯的提取率研究結果有所差異，這可能是由于角鯊烯存在于不同的基質中所造成的。

2.2 提取方法的選擇

關于角鯊烯的提取方法以索氏提取法和皂化提取法居多[27， 28]，但這兩種方法耗時較多、步驟復雜。為了探索簡單、便捷的提取方法，本試驗在以三氯甲烷為提取劑的基礎上，對烤煙中角鯊烯不同提取方法（超聲波輔助提取法、索氏提取法、皂化提取法、冷浸提取法）進行比較，同時對超聲波輔助提取法中的超聲時間對提取率的影響進行了驗證。結果（圖2）表明，利用超聲波輔助提取法對烤煙樣品超聲提取40 min，提取率較其它三種提取方法高且用時較少，因此，試驗中選擇超聲波輔助提取法（40 min）對烤煙中的角鯊烯進行提取。

2.3 凈化劑的選擇

烤煙樣品中基質較復雜，檢測樣品中角鯊烯時干擾因素較多，且利用分散固相萃取法、液液萃取法等凈化方法效果均不理想。在樣品前處理過程中，選擇利用固相萃取法對樣品進行凈化。試驗中考察了硅膠與PSA（N-丙基乙二胺填料）兩種凈化柱凈化效果，結果（圖3、圖4）表明，利用硅膠凈化柱的凈化效果優于PSA凈化柱，因此，試驗中選擇利用硅膠凈化柱對烤煙樣品進行凈化處理。

2.4 色譜柱的選擇

考察了不同類型的反相色譜柱對烤煙樣品的分離分析效果，并對高效液相的色譜條件進行了優化選擇。烤煙樣品經色譜柱Agilent HC-C8 （5 μm，4.6 mm×250 mm）檢測的出峰時間比Agilent SB-C18 （5 μm，4.6 mm×250 mm）提前17 min，但Agilent HC-C8對樣品檢測的重現性不好且干擾較多。考慮到檢測方法的準確度和重現性等因素，試驗中選用Agilent SB-C18 （5 μm，4.6 mm×250 mm）作為烤煙樣品的分離分析色譜柱。

2.5 標準曲線、檢出限及定量限

角鯊烯系列標準溶液于高效液相色譜儀進樣檢測，以進樣濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，建立角鯊烯的標準工作曲線，角鯊烯的線性回歸方程為y=53.013x+0.6452，相關系數r=0.9976。試驗結果表明，角鯊烯濃度在0.5～10.0 mg/L范圍內線性良好；分別以儀器信噪比（S/N=3，S/N=10）所對應的溶液濃度計算得出該方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別為0.12、0.39 mg/L。角鯊烯標準品和烤煙樣品（凈化后）的色譜圖分別見圖5、圖6。endprint

2.6 方法的精密度

按1.2方法對樣品進行前處理，在1.3的色譜條件下對待測樣品進行檢測分析（平行試驗，n=5），檢測方法的日內與日間精密度（RSD）分別為3.12%、3.46%，結果（表1）表明，該檢測方法的精密度良好。

2.7 加標試驗

按1.2方法對樣品進行前處理，在1.3的色譜條件下對待測樣品進行檢測（平行試驗，n=5），計算得出烤煙樣品中角鯊烯的本底含量約為10.0 mg/kg。分別以烤煙樣品中角鯊烯本底值的1.5倍（高）、1.0倍（中）、0.5倍（低）進行三個濃度水平添加，測定烤煙中角鯊烯的加標回收率。試驗結果（表2）表明，烤煙中角鯊烯的平均加標回收率為88.12%，該檢測方法回收率較好。

2.8 不同地區烤煙中角鯊烯含量測定

取5個地區的烤煙樣品，按1.2方法對樣品進行前處理，在1.3的色譜條件下對待測樣品進行檢測（平行試驗，n=5），試驗結果（表3）中測得不同地區烤煙中角鯊烯含量在10.0～12.9 mg/kg，不同地區由于種植環境等因素不同，烤煙樣品中角鯊烯含量也有所差異。

3 結論

本研究對烤煙樣品的前處理方法和高效液相色譜條件進行了優化，建立了烤煙中角鯊烯含量的固相萃取-高效液相色譜（SPE-HPLC）檢測方法。該方法的線性范圍為0.5～10 mg/L，回收率為84.68%～92.29%，檢出限和定量限分別為0.12、0.39 mg/L。利用已確定的方法測定5個不同地區的同品種烤煙中角鯊烯含量范圍為10.0～12.9 mg/kg，這可能是由于種植環境不同所造成的。該方法具有準確度高、重現性好的特點。

參 考 文 獻：

[1] 陳璐， 曹棟， 丁敏， 等. 大豆油脫臭餾出物中角鯊烯提取工藝研究[J]. 中國油脂，2014，39（9）：67-70.

[2] 吳時敏. 角鯊烯開發利用[J]. 糧食與油脂，2001（1）：36.

[3] 龔麗， 常偉， 黃湛， 等. 橄欖油中角鯊烯的提取與檢測[J]. 食品與發酵科技， 2013， 49（5）：72-74.

[4] Gonzalez A G， Grillo T A， Ravelo A G， et al. Study of Salvia palaefolia： absolute configuration of glechomafuran[J]. Journal Natural Products，1989， 52（6）：1307-1310.

[5] Ageta H， Masuda K， Tanaka Y. Fern constituents on the oxigen of a Formosan native drug“Tie-yu-san” and its triterpenoid constituents[J]. Japanese Journal of Pharmacognosy，1981， 35（4）： 259-261.

[6] Toyota M， Nagashima F， Asakawa Y. Volatile components and pinguisane-type sesquiterpenoids from the liverwort porella cordaeana [J]. Phytochemistry， 1989， 28（12）：3383-3387.

[7] Solberg Y J. Chemical constituents of the lichens Cetraria delisei， Lobaria pulmonaria， Sterocaulon tomentosum and Usnea hirta [J]. Journal of the Hattori Botanical Laboratory，1988， 63： 357-366.

[8] Rao B V K， Murthy P S N， Chakraborty M K， et al. Chemical studies on Lanka tobacco （indigenous to India） and its smoke[J]. J. Indian Chem. Soc.， 1988， 65（12）：855-858.

[9] Frei B， Forte T M， Ames B N， et al. Gas phase oxidants of cigarette smoke induce lipid peroxidation and changes in lipoprotein properties in human blood plasma protective effects of ascorbic-acid[J]. Biochemical Journal，1991， 277（1）：133-138.

[10]Ambrose J A， Barua R S. The pathophysiology of cigarette smoking and cardiovascular disease： an update[J]. Journal of the American College of Cardiology， 2004， 43（10）：1731-1737.

[11]Santanam N， Sanchez R， Hendler S， et al. Aqueous extracts of cigarette smokepromote the oxidation of low density lipoprotein by peroxidases[J]. FEBS Letters，1997，414：549-551.endprint

[12]Bermúdez E， Stone K， Carter K M， et al. Environmental tobacco smoke is just as damaging to DNA as mainstream smoke[J]. Environmental Health Perspectives， 1994，102（10）：870-874.

[13]毛紹春， 李竹英， 李聰. 訶子提取物降低香煙煙氣自由基的應用研究[J]. 現代儀器， 2007，13 （3）：41-43.

[14]Verkooijen H M， Ang J X， Liu J， et al. Mortality among offspring of women diagnosed with cancer. A population-based cohort study[J]. International Journal of Cancer，2013，132 （10）：2432-2438.

[15]Yuan L， Zhang Y X， Jin Y B， et al. ESR study on scavenging effect of squalene on free radicals in mainstream cigarette smoke[J]. Appl. Magn. Reson.， 2017， 48（2）：201-212.

[16]吳彥， 楊鴻， 劉紅， 等. 中藥組分清除煙氣有害物質及降低細胞毒性的研究[J]. 中國中藥雜志， 2011，36（22）：3184-3188.

[17]Shen X， Zhong K J， Sun X J， et al. Scavenging effects of plant antioxidants on gas-phase free radicals in mainstream cigarette smoke [J]. Analytical Letters，2010， 43（3）：446-454.

[18]Roemer E， Dempsey R， Lawless P J， et al. Toxicological assessment of kretek cigarettes part 4： mechanistic investigations， smoke chemistry and in vitro toxicity[J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology，2014，70（1）：S41-S53.

[19]Tapiero H， Townsend D M， Tew K D. The role of carotenoids in the prevention of human pathologies[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy，2004， 58（2）：100-110.

[20]周國俊， 劉建福， 趙立紅， 等. 卷煙煙氣自由基檢測與清除方法研究綜述[J]. 煙草科技，2004 （6）：29-36.

[21]Sagratini G， Allegrini M， Caprioli G， et al. Simultaneous determination of squalene， α-tocopherol and β-carotene in table olives by solid phase extraction and high-performance liquid chromatography with diode array detection[J]. Food Analytical Methods， 2013， 6（1）：54-60.

[22]殷艷華， 陳澤鵬， 陳永明， 等. GC/MS法檢測24種烤煙煙氣中角鯊烯含量[J]. 廣東農業科學， 2012 （3）：105-107.

[23]Secmeler ， stundag G.A rapid in-house validated GC-FID method for simultaneous determination of lipophilic bioactives in olive oil： Squalene， α-tocopherol， and β-sitosterol[J]. European Journal of Lipid Science and Technology，2017，119（1）：1500420.

[24]Huo Q， Wang Z P， Xiong S X， et al. Determination of volatile organic compounds in pepper seeds by GC/MS[J]. Asian Journal of Chemistry，2013， 25（16）：8909-8912.

[25]Iordanescu I P， Popa O， Babeanu N， et al. Physico chemical characterization of amaranth extracts from romanian vegetal sources with antioxidant and antiinflammatory activities[J]. Revista De Chimie， 2015，66（5）：634-636.

[26]李冬梅，王婧，畢良武，等. 提取方法對茶油中活性成分角鯊烯含量的影響[J]. 生物質化學工程，2006（1）：9-12.

[27]劉延平，于薈，馬文平，等. 氣相色譜-質譜聯用法測定油用牡丹花蕊和花粉中角鯊烯含量[J]. 化學分析計量， 2015（6）：52-55.

[28]石磊嶺，馬元甲，古麗娜·沙比爾，等. 天山假狼毒和瑞香狼毒葉中揮發性成分的分析研究[J]. 新疆醫科大學學報，2017，40（1）：82-85.endprint