膠凍樣芽孢桿菌發酵中試研究

廖先清+劉芳+周榮華+饒犇+陳偉

摘要：利用單因素篩選和正交試驗，對膠凍樣芽孢桿菌菌株NBF-266的發酵培養基進行了優化，得到其最佳培養基配方為甘油0.8%，淀粉0.6%，花生粕1.5%，碳酸鈣0.1%。通過400 L和5 000 L發酵罐分別發酵，發酵液芽孢產量分別為18×108 CFU/mL和15.8×108 CFU/mL，發酵液經不同方式濃縮干燥，得到凍干粉和噴霧干燥粉芽孢產量分別為2 910×108 CFU/g和933×108 CFU/g。

關鍵詞：膠凍樣芽孢桿菌；芽孢產量；優化；中試生產

中圖分類號：Q939.96 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）23-4513-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.23.023

Abstract： The fermentation medium for Bacillus mucilaginous NBF-266 strain was optimized through single factor screening and orthogonal experiments. The composition of the optimized medium was glycerin 0.8%， starch 0.6%， peanut meal 1.5%， calcium carbonate 0.1%. Pilot production of B. mucilaginous was carried out in 400 L and 5 000 L fermentor， spore yield of the fermentation broth were 18×108 CFU/mL and 15.8×108 CFU/mL respectively. The fermentation broth was concentrated and dried in two different ways， spore yield of the freeze-dried powder and spray drying powder were 2 910×108 CFU/g and 933×108 CFU/g respectively.

Key words： Bacillus mucilaginous； spore yield； optimization； pilot production

微生物肥料是一類通過活體微生物發揮肥效的特殊肥料[1]。膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginous）是一種能分解硅酸鹽礦物的特殊細菌，它因具有分解硅酸鹽礦物、溶磷、解鉀、固氮等和增強作物抗病能力等多種特點而被制成微生物肥料[2]，目前已廣泛應用于各種農作物，增產效果明顯[3]。但其生產工藝有待改變和提高，大多微生物肥料生產還在延續20世紀70和80年代的發酵后發酵液直接吸附或液體灌裝的生產模式，無后處理工藝[4]，致使產品活菌數和芽孢形成率均較低，貨架期也較短，增 產效果不穩定。

近年來關于膠質芽孢桿菌發酵條件多有研究，但針對該菌的中試發酵和濃縮干燥研究卻鮮有報道。因此本研究擬通過一株膠質芽孢桿菌發酵培養基、工藝條件進行研究，并通過400 L小罐和5 000 L罐進行中試驗證，獲得可產生高密度活菌數和高芽孢率的發酵和濃縮干燥工藝，從而提高微生物菌肥產品中的有效活菌數和芽孢率，延長貨架期，改善微生物肥料的質量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 供試膠凍樣芽孢桿菌菌株NBF-266由湖北省生物農藥工程研究中心實驗室分離并保存。

1.1.2 培養基 斜面培養基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基。

1.2 方法

1.2.1 培養方法 斜面活化培養：將保存于砂土管的菌種轉接于斜面培養基，30 ℃培養至全部形成孢子。

搖瓶發酵培養：挑取一環斜面菌苔接入發酵培養基，搖瓶發酵裝液量為50 mL/500 mL，32 ℃、220 r/min振蕩培養至芽孢20%左右脫落。

1.2.2 分析方法 活菌數及芽孢產量測定采用稀釋平板計數法測定每單位體積或單位重量內含有的活菌數[5]。

1.3 試驗設計

1.3.1 碳源單因子篩選 固定氮源為2%豆粕粉，選取蔗糖、飴糖、糖蜜、甘油、淀粉等幾種常見的工農業副產物[6]作為碳源進行篩選。

1.3.2 氮源單因子篩選 選取碳源單因素篩選中確定的最佳碳源，選用魚粉、蛋白胨、豆粕、花生粕等工農業副產品作為氮源進行篩選。

1.3.3 正交試驗 通過單因素試驗確定膠凍芽孢桿菌的最佳碳氮源和中心水平，選取碳氮源和無機鹽進行4因子3水平正交試驗，尋找最佳配方。

1.3.4 400 L罐發酵小試 利用單因素和正交試驗得出的最佳配方，在400 L發酵罐中進行發酵試驗，投料體積240 L，消泡劑0.1%，滅菌前調pH至7.5，滅菌、降溫至35 ℃，接入200 mL孢子懸浮液，通氣量12 m3/h，罐壓0.5×105 Pa，32 ℃培養至芽孢脫落20%時放罐。發酵液實驗室高速離心機離心5 000 r/min，10 min，棄去部分上清液，得到3倍濃縮液，濃縮液冷凍干燥得到凍干粉。

1.3.5 5 000 L罐發酵中試 采用優化后的配方，投料體積3 000 L，消泡劑0.1%，滅菌前調pH至7.5，滅菌、降溫至35 ℃，接入1 000 mL孢子懸浮液，通氣量150 m3/h， 罐壓0.5×105 Pa，32 ℃培養至芽孢脫落20%時放罐。發酵液采用兩種方式處理：一是取少量發酵液實驗室離心，得到3倍濃縮液，冷凍干燥；二是車間碟片式離心機離心，濃縮液經離心式噴霧干燥塔噴霧干燥得到原粉。

2 結果與分析

2.1 碳源單因子試驗結果

碳源的篩選試驗如表1所示。不同碳源對活菌量及芽孢的形成有很大的影響，在分別以葡萄糖、甘露醇、乳糖、飴糖為碳源的情況下菌量小且均不能形成芽孢， 在淀粉中菌量最大但只有60%可形成芽孢，而在甘油、糖蜜等碳源中可形成芽孢，菌量可達4.7×108 CFU/mL。這可能是因為在乳糖、葡萄糖等還原性糖為碳源的培養基中，菌體生長過快從而積累生理酸性物質，pH長期低于6.0且很難回升，導致菌體無法形成芽孢直至衰老、自溶[6]。也有可能是因為速效碳源、菌體營養生長過盛。綜合碳源的還原性和遲效性，選用甘油和玉米淀粉作為復合碳源[7]進行下一步的試驗。

2.2 氮源單因子試驗結果

氮源的篩選試驗如表2所示。從表2可以看出，除玉米漿粉外，這幾種有機氮源對膠凍樣芽孢桿菌產孢率影響并不大。活菌數差別較大，以花生粕、蛋白胨、玉米酒糟為氮源時菌量均超過10×108 CFU/mL，尤以花生粕為氮源時菌量18.5×108 CFU/mL。綜合芽孢產量、成本等因素，確定花生粕為最佳氮源。

2.3 正交試驗結果

在單因子試驗的基礎上選取復合碳源、氮源和無機鹽進行4因子3水平正交試驗。正交試驗的水平與因子的確定、正交試驗結果、方差分析分別見表3、表4、表5。從表4和表5方差分析結果表明，這4種成分主效應排序為甘油>淀粉>碳酸鈣>花生粕。兩種碳源甘油、淀粉的F值分別為1.954、1.716，對芽孢產量的影響最大，而花生粕和碳酸鈣對發酵的影響不是很大。確定最佳配方為甘油0.8%，淀粉0.6%，花生粕1.5%，碳酸鈣0.1%。

2.4 400 L試驗罐發酵

發酵周期39 h，發酵29 h取樣鏡檢，個別形成孢囊，菌體大小整齊。放罐時取樣鏡檢，芽孢50%左右脫落，大小一致，同步率98%。將發酵液和冷凍干燥粉分別進行稀釋平板計數，發酵液芽孢產量18×108 CFU/mL，3倍濃縮液凍干粉芽孢產量2 748×108 CFU/g。

2.5 5 000 L發酵罐發酵

發酵周期43 h，發酵34 h取樣鏡檢，大部分菌體膨大，菌體大小整齊。放罐時取樣鏡檢，孢子少量脫落，大小一致，同步率98%。將發酵液、冷凍干燥粉、噴霧干燥粉分別進行稀釋平板計數，結果見表6。5 000 L中試放大，相對于400 L罐，不論從孢子形成率、芽孢產量、發酵周期都相當，證明中試放大方案是可行的。5 000 L發酵液噴霧干燥粉水平與冷凍干燥粉相差較大，可能原因有二：一是離心濃縮工藝中參數設置不當，離心過程中孢子隨著上清液流失較多；二是芽孢耐熱性能與其他芽孢桿菌有差異，噴霧干燥過程中有損失。

3 小結與討論

通過單因素碳氮源篩選和正交試驗，獲得膠凍樣芽孢桿菌菌株最佳培養基配方為甘油 0.8%淀粉0.6%，花生粕1.5%，碳酸鈣0.1%。采用該配方進行了400 L和5 000 L發酵罐小試和中試試驗，發酵液和濃縮干燥粉芽孢產量均達到較高水平，尤其是冷凍干燥粉最高達2 910×108 CFU/g，噴霧干燥粉達933×108 CFU/g，具備了工業化生產的條件。

小試和中試發酵水平相對于搖瓶發酵存在差距，究其原因，可能與發酵過程中中間控制工藝包括培養溫度、溶氧、pH控制等有關，下一步繼續進行發酵工藝的優化。針對5 000 L發酵液噴霧干燥粉水平與冷凍干燥粉相差較大，將進行后處理工藝技術的優化，一是優化濃縮和干燥工藝，二是濃縮干燥過程中添加保護劑，盡量減少后處理過程中的損失，提高收率。

參考文獻：

[1] 謝宗鵬.復合微生物菌肥的作用及其功效[J].農業科技與信息，2015（18）：75-76.

[2] 扎史品楚，農傳江，王宇蘊，等.生物有機肥的發酵工藝及應用效果研究[J].環境工程，2015，33（增刊）：1011-1014，1020.

[3] 吳向華，劉五星.膠凍樣芽孢桿菌培養條件及發酵工藝的優化[J].江蘇農業科學，2006（4）：155-158.

[4] 張愛民，李乃康，趙鋼勇，等.土壤中解磷、解鉀微生物研究進展[J].河北大學學報（自然科學版），2015，35（4）：442-447.

[5] 周德慶.微生物學實驗手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1986.

[6] 李 冰，趙 勛，王 巖，等.膠質芽孢桿菌工業化發酵研究進展[J].農業科學研究，2014，35（1）：68-72.

[7] 周榮華，崔怡寧，饒 犇，等.多粘芽孢桿菌發酵放大工藝研究[J].湖北農業科學，2015，54（11）：2034-2036.