博萊霉素對突變ataxin—3引起的細胞凋亡的影響

王子見 吳文成

摘 要：脊髓小腦共濟失調III型（SCA3）是一種常染色體顯性遺傳的神經退行性疾病，目前尚無有效的治療藥物，只能通過某些藥物緩解癥狀。硫酸博萊霉素也稱博萊霉素（Bleomycin），用于治療腫瘤，其作用機制涉及自噬，氧化應激等途徑，而這2個通路在SCA3致病過程起重要作用。該研究采用四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT法）探索博萊霉素對突變ataxin-3引起的細胞凋亡的影響。實驗結果表明，在藥物處理2h后，博萊霉素對SCA3細胞沒有毒性作用，也沒有抑制細胞凋亡的作用；在藥物處理24h后，在1000μM濃度時，博萊霉素對SCA3細胞有顯著毒性作用。該研究不僅豐富了舊藥新發現，也為神經退行性疾病治療提供了參考依據。

關鍵詞：硫酸博萊霉素；脊髓小腦共濟失調III型；細胞凋亡

中圖分類號 R744.7 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）20-0032-3

Effect of Bleomycin Sulfate on the Apoptosis Induced by Ataxin-3

Wang Zijian et al.

（College of Biological and Environmental Engineering，Xian University，Xian 710065，China）

Abstract： Spinocerebellar ataxia type 3 is an autosomal dominant neurodegenerative disorder.There is no effective treatment at present，but it can be relieved by several medications.Bleomycin sulfate，also known as bleomycin，is used to treat tumors partly via autophagy and oxidative stress pathway which play an important role in SCA3. This study assesses the effect of bleomycin on the apoptosis induced by mutant ataxin-3 by MTT assay. The experimental results showed that after 2 hours of drug treatment，bleomycin did not show the did not inhibit the apoptosis.24 hours after the drug treatment，the apoptosis was enhanced by bleomycin at a concentration of 1000μM. This investigation provides new function of old drug and also supplies a proof for neurodegeneration diseases in further studies.

Key words：Bleomycin sulfate；Spinocerebellar ataxia type 3；Apoptosis

遺傳性脊髓小腦共濟失調（Spinocerebellar ataxias，SCAs）是一類影響人類神經系統的遲發型神經退行性疾病，其具有動態突變的特征，致病機理復雜，由三核苷酸動態突變擴展引起[1]，呈常染色體顯性遺傳，臨床上具有多種表現特征，如共濟失調、弓形足、視神經萎縮、脊柱側彎、心肌病、認知功能受損、眼肌麻痹、失明、痙攣、肌肉萎縮和感覺障礙等癥狀。除此之外，研究發現大多數SCA的臨床表現涉及到多個系統，除了影響小腦和脊髓之外，還影響其他區域如中樞和外周系統[2]。據報道，SCAs包括SCA1-14（無SCA9）13個亞型，其中發病率最高的是脊髓小腦共濟失調Ⅲ型（SCA3）[3]，以痙攣性共濟失調為突出表現，發病方式呈家族性和發散性，疾病的相關基因是ATXN3，編碼的蛋白是ataxin-3[4]，該基因CAG重復擴增，正常人CAG以12～42次為正常重復次數，患者為52～84次，SCA3患者診斷方法有臨床診斷和基因診斷2種。目前沒有有效的藥物對其進行治療，臨床治療以延緩病情發展和對癥治療為主，以提高患者的生活質量。硫酸博萊霉素是一種廣譜的抗腫瘤藥物，也用來誘導建立肺纖維化動物模型[5]。肺纖維化和自噬相關，自噬在肺纖維化和纖維增生性肺病的發病過程中可能起到了雙重作用，而氧化應激、內質網應激、缺氧等因素也參與了肺纖維化發病過程[6]。在神經退行性疾病中，尤其是SCA3，自噬和氧化應激在突變蛋白核異位，形成的聚集體等發病過程中起到了重要作用[7]。因此，本實驗通過ataxin-3突變質粒轉染HEK293細胞（人胚腎細胞），構建SCA3細胞模型，采用MTT方法，研究博萊霉素對突變ataxin-3引起的細胞凋亡的影響。此課題揭示博萊霉素舊藥新作用，為SCA3/MJD疾病的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 HEK293細胞由倫敦大學學院薛少安教授惠贈。peGFP-ataxin-3-77CAG質粒由德國圖賓根大學Thorsten Schimdt博士惠贈。博萊霉素購自Selleck Chemical公司（Cat.No.S1214）。

1.2 方法

1.2.1 質粒轉化和提取 取出感受態細胞DH5α（大腸桿菌）于冰上融化，加入質粒，混勻，置于冰上30min；隨后42℃熱擊90s，迅速置冰上，加入不含抗生素的LB培養基混勻，37℃恒溫搖床（150r）搖45min。取出菌液，劃線涂板，37℃倒置過夜培養；選取菌落進行挑菌，PCR鑒定。將PCR鑒定成功的菌落挑出，加入培養基，37℃搖床（150r）搖菌過夜。次日，取出菌液，離心（2000r，10min），棄去上清液，按照GIAGEN plasmid mini kit試劑盒說明書提取質粒，使用Nanodrop2000檢測質粒濃度。

1.2.2 轉染與加藥 按照梭華sofast轉染試劑說明書，取2μg質粒，3μL梭華sofast，100μL培養液，室溫靜置30min，加入到六孔板內。24h后，轉移至96孔板，24h后加藥處理，DMSO為陰性對照組，只含細胞為未處理對照組，藥物時間分別為2h和24h。

2 結果與分析

2.1 SCA3細胞模型的構建 通過將ataxin-3-77Q質粒轉染至HEK293細胞，使其蛋白表達，構建SCA3細胞模型。轉染48h后，收集和裂解細胞，提取細胞總蛋白，檢測細胞中含擴增PolyQ的突變ataxin-3蛋白。Western blot結果顯示，HEK293細胞過表達ataxin-3-77Q蛋白，SCA3細胞模型構建成功（圖1）。如圖1所示，采用ataxin-3蛋白抗體（1H9抗體）和β-actin蛋白抗體孵育，得到75KD大小的突變ataxin-3蛋白和42KD大小的β-actin蛋白，其中1-2是不同蛋白樣本。

2.2 博萊霉素處理SCA3細胞模型2h后的影響 加入不同濃度的溶解在水中的博萊霉素2h后，以陰性對照組水為對照，MTT結果顯示，博萊霉素濃度從1000μM到1μM時，細胞活性有上升的的趨勢，并且在藥物濃度為1μM時所對應的OD值最高，即此濃度對應的細胞凋亡數目最少（圖2）。但是通過獨立樣本T-檢驗可知，該濃度和陰性對照組相比P=0.7096（P>0.05），無顯著性。因此，在藥物處理2h后，不同濃度的博萊霉素對SCA3細胞模型沒有毒性，對細胞活性也沒有顯著的影響。

2.3 博萊霉素處理SCA3細胞模型24h后的影響 博萊霉素處理SCA3細胞模型2h后，對細胞活性沒有顯著影響，因此繼續加大作用時間，將藥物處理細胞24h后觀察結果。以陰性對照組水為對照，MTT結果顯示，博萊霉素濃度從1000μM下降到0.01μM時，細胞活性有上升的的趨勢，但是，通過獨立樣本T-檢驗可知，不同濃度和陰性對照組相比均P>0.05，仍無顯著性。但是，當博萊霉素濃度在1000μM，能夠顯著增加細胞毒性（或增加細胞凋亡）（P<0.05）。因此，不同濃度的博萊霉素處理SCA3細胞模型24h后，對細胞活性沒有顯著影響，但是濃度在1000μM時，對細胞模型有毒性（圖3）。

3 結論與討論

脊髓小腦共濟失調III型（SCA3）是由于ATXN3基因突變導致，會引起CAG重復序列異常增加，其表達出的蛋白質異常，出現錯誤折疊，進而形成核內包涵體引起細胞凋亡。硫酸博萊霉素，是一種廣譜抗腫瘤藥，作用機制主要是通過與DNA結合引起核酸鏈斷裂，除此以外，該FDA藥物還涉及自噬，氧化應激等途徑。重要的是該藥物可以通過血腦屏障，對于神經系統疾病意義重大。基于以上理論，本研究探索硫酸博萊霉素是否可能影響SCA3細胞活性。通過MTT實驗數據分析得出，以H2O為陰性對照組，加藥2h后，博萊霉素藥物處理組6個濃度與對照組作樣本T-檢驗時發現，P值均大于0.05，故無顯著性，表明不同濃度的藥物處理2h后對細胞沒有毒性；加藥處理24h后，博萊霉素藥物處理組6個濃度與對照組作樣本T-檢驗時得出，濃度在1000μM時，可以顯著增加細胞毒性。因此，可以推斷，硫酸博萊霉素隨著加藥時間變長，其毒性效果變得更明顯，這為下一步進行該藥物對ataxin-3核轉運和聚集體的形成的影響等研究提供了濃度和作用時間參考依據。此外，在利用GraphPad Prism軟件進行統計學分析時，發現error bar個別偏大，特別是加藥處理2h的數據，這也可能是由于在加入MTT時，DMSO時并未完全使其混勻，會導致OD值有所變化。在最后棄去上清時，甲臜易被棄去從而導致實驗數據誤差較大。綜上所述，硫酸博萊霉素對突變ataxin-3引起的細胞凋亡沒有顯著影響，在高濃度時還會產生細胞毒性。因此，下一步還需要探討該FDA藥物對SCA3細胞模型其他的病理變化，比如突變ataxin-3核異位以及形成的“有毒”包涵體的影響。

參考文獻

[1]Zijian Wang.Experimental and clinical strategies for treating spinocerebellar ataxia type 3，Neuroscience.2018 Feb 10； 371：138-154.doi：10.1016/j.neuroscience.2017.11.051.

[2]Paulson H.Machado-Joseph disease/spinocerebellar ataxia type 3[J].Handb Clin Neurol，2012，103：437-449.

[3]黃麗華，周華東.脊髓小腦型共濟失調的研究進展[J].重慶醫學，2008（07）：732-735.

[4]Saute JAM，Jardim LB （2015） Machado Joseph disease： clinical and genetic aspects，and current treatment[J].Expert Opin Orphan Drugs 3：517-535.

[5]金曉光，代華平，龐寶森，等.博來霉素致大鼠肺纖維化模型肺組織的動態病理變化及其發生機制[J].中國病理生理雜志，2009，25（4）：708-714.

[6]王妍妮，王昌明.細胞自噬在肺纖維化中作用的研究進展[J].中國呼吸與危重監護雜志，2016，15（4）：417-420.

[7]花芳，余嬌嬌，李珂，等.自噬影響衰老及老年病的研究進展[J].藥學學報2014，49（6）：764-773.

（責編：張宏民）