Neuritin與HSP60在大鼠肝損傷組織中的表達及其意義*

吳江文，朱美意，歐陽軍，周濤，曹東

（石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 急診外科，新疆 石河子 832008）

Neuritin與HSP60在大鼠肝損傷組織中的表達及其意義*

吳江文，朱美意，歐陽軍，周濤，曹東

（石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 急診外科，新疆 石河子 832008）

目的研究大鼠肝損傷后不同時間Neuritin和熱休克蛋白60（HSP60）的表達，探討Neuritin和HSP60在大鼠肝損傷修復過程中的作用。方法將126只SD大鼠隨機分為肝損傷組、骨折組和正常組，分別檢測各組術后6 h、12 h、1d、3d、5d、7d和14d 7個時間點的血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）濃度，并取肝組織行蘇木精-伊紅和免疫組織化學法染色，觀察肝臟病理學改變及Neuritin、HSP60的表達。結果肝損傷組大鼠血清ALT、AST濃度在6 h、12 h、1d時高于骨折組、正常組（P＜0.05）。免疫組織化學法結果表明，肝損傷組大鼠Neuritin和HSP60的表達水平在各個時間點（6 h除外）高于骨折組、正常組（P＜0.05），且兩者的表達水平均呈先升高后降低的趨勢，骨折組大鼠HSP60的表達水平在12 h、1d時高于正常組（P＜0.05），骨折組大鼠Neuritin的表達水平與正常組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結論Neuritin與HSP60相互作用，可能是促進肝損傷修復的重要因素。

肝損傷；骨折；Neuritin；熱休克蛋白60

肝損傷在腹部損傷中十分常見，然而肝損傷修復分子機制仍未明確[1-2]。Neuritin是NEDIVI等[3]從大鼠海馬cDNA文庫中篩選鑒定出與可塑性相關的候選基因，其在神經發(fā)育及損傷修復中發(fā)揮重要作用。目前Neuritin與肝損傷修復的研究較少，課題組應用基因信息學技術及酵母雙雜交技術[4]，在胎腦中發(fā)現多條與Neuritin有相互作用的蛋白質和基因，其中包含熱休克蛋白60（heat shock protein 60，HSP60）。因此本實驗復制大鼠肝損傷模型，探討Neuritin和HSP60在大鼠肝損傷修復過程中的表達，以及可能的作用機制和意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6周齡SD大鼠購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心。動物合格證號：SCXK（新）2011-0003，飼養(yǎng)設施合格證號：SYXK（新）2011-0001。

1.2 主要試劑及儀器

Neuritin多克隆抗體（型號AF283）（美國R&D公司），HSP60單克隆抗體（型號ab59457）（英國Abcam公司），相應二抗購自北京中杉金橋公司。免疫組織化學法石蠟包埋機及石蠟切片機購自德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組及模型的復制126只SD大鼠按隨機數字表法隨機分為肝損傷組、骨折組和正常組，每組42只。各組再按隨機數字表法隨機分為6 h、12 h、1d、3d、5d、7d、14d 7個時間點（各6只）。肝損傷組參照第三軍醫(yī)大學大鼠肝臟損傷動物模型[5]，骨折組采用股骨截股模型，大鼠麻醉后，取右下肢股外側切口暴露股骨干，用電動擺鋸將股骨中段鋸斷，克氏針逆行插入經股骨大轉子穿出，將克氏針順行插入骨折遠端復位骨折，將大轉子根部針尾部克氏針折彎后剪除多余部分，逐層閉合切口。正常組做空白處理。

1.3.2 血清谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate transaminase，AST）濃度的監(jiān)測麻醉后打開大鼠腹腔，用采血管自下腔靜脈采血5 ml，立即4000 r/min離心8 min，取上清液送往石河子大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，由固定的專業(yè)人員利用全自動生化儀監(jiān)測血清ALT、AST濃度。

1.3.3 肝臟組織切片蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）及病理學觀察肝損傷組取損傷處肝組織，骨折組和正常組均取左側肝葉組織，切取的肝組織經甲醛固定后制作石蠟切片，行HE染色，常規(guī)顯微鏡下觀察并記錄。

1.3.4 免疫組織化學法免疫組織化學法檢測Neuritin與HSP60的表達。采用Envision兩步法：取制作好的肝組織切片，烘干后脫蠟至水，加熱修復抗原，3%雙氧水H2O210 min封閉；添加相應一抗4℃孵育過夜；震洗后滴加相應第二抗體，37℃孵育30 min；震洗，顯色后進行蘇木精核復染，經脫水、透明后封片保存。光鏡下觀察Neuritin、HSP60的表達，以胞漿呈棕褐色為陽性細胞。結果評分采用AB值法。A：按切片中細胞有無顯色及深淺評分，細胞無著色計0分；顯色為淺黃色計1分；深黃色計2分；棕褐色計3分。B：按切片中顯色細胞比例評分，顯色細胞＜1/3切片中細胞總數計1分；1/3～2/3細胞顯色計2分；＞2/3細胞顯色計3分。每例樣本積分= A×B。每張切片在200倍光鏡下隨機選取5個無重疊視野，評分后取算術平均值進行下一步統計學處理。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清ALT、AST濃度比較

肝損傷組大鼠血清ALT、AST濃度在6 h、12 h、1d時高于骨折組和正常組（P＜0.05），其余時間點3組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。骨折組AST濃度在6 h、12 h、1d時升高，且與肝損傷組及正常組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1、2。

2.2 肝臟病理學變化

光鏡下觀察各組大鼠肝臟組織。肝損傷組大鼠6 h～1d可見肝小葉結構破壞，周邊見紅色出血帶，肝竇內可見大量紅細胞，部分肝細胞水腫；肝損傷后3和5d，肝細胞索結構紊亂，仍可見出血，肝小葉周邊細胞普遍增大，胞漿水腫，局部點狀壞死，偶見核分裂象，肝血竇周圍可見炎癥細胞浸潤；肝損傷后7和14d，出血明顯減少，仍見淋巴細胞及中性粒細胞浸潤，內皮細胞明顯增多，可見新生毛細血管形成。骨折組大鼠肝臟肝小葉結構稍紊亂，局部細胞質疏松，可見少量炎癥細胞。見圖1。

表1 各組不同時間點ALT濃度比較 （n =6，u/L，±s）

注：?與正常組、骨折組比較，P ＜0.05

組別 6 h 12 h 1d 3d 5d 7d 14d肝損傷組 104.17±4.07? 424.50±10.84? 64.00±7.15? 40.33±7.56 44.83±11.70 36.33±9.95 43.17±6.18骨折組 44.00±5.02 43.00±4.56 42.33±5.46 38.17±6.24 39.67±8.98 42.00±5.41 43.17±10.30正常組 38.83±6.61 40.00±6.19 42.17±9.95 39.50±5.89 47.00±7.04 41.50±6.65 43.50±8.45 F值 277.617 4981.180 15.767 0.184 0.956 0.960 0.0030.000.003 P值 0.000 0.000 0.000 0.834 0.407 0.405 0.997

表2 各組不同時間點AST濃度BJ （n =6，u/L，±s）

表2 各組不同時間點AST濃度BJ （n =6，u/L，±s）

注：1）與正常組比較，P ＜0.05；2）與骨折組比較，P ＜0.05

組別 6 h 12 h 1d 3d 5d 7d 14d肝損傷組 271.00±15.831）2）787.67±32.681）2）210.17±18.691）2） 93.50±12.80 76.50±7.14 69.83±9.13 63.33±9.13骨折組 127.50±7.011） 185.17±10.741） 143.00±19.601） 83.17±9.63 69.83±12.60 65.00±7.62 67.33±8.61正常組 65.50±8.552） 68.83±12.772） 77.33±14.282） 77.00±9.19 71.83±10.15 67.50±9.40 71.33±6.56 F值 536.192 1990.628 90.890 3.688 0.673 0.458 1.088 P值 0.000 0.000 0.000 0.050 0.525 0.641 0.362

圖1 肝臟病理學變化 （HE染色×200）

2.3 肝臟組織Neuritin、HSP60的表達

2.3.1 Neuritin光鏡下觀察Neuritin、HSP60均表達于細胞漿，著色肝細胞圍繞匯管區(qū)分散排列。肝損傷組在各時間點（6 h除外）Neuritin評分高于骨折組和正常組（P＜0.05）；各時間點的表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），且隨時間推移，表達呈先升高后下降的趨勢。隨時間推移，骨折組與正常組的表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；且各時間點比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2和表3。

2.3.2 HSP60肝損傷組HSP60的表達水平也呈先升高后下降的趨勢，且在12 h、1d、3d、5d、7d、14d時的評分高于骨折組和正常組（P＜0.05）。骨折組HSP60的表達隨著時間變化，差異有統計學意義（P＜0.05），且在12 h、1d時表達水平較正常組高（P＜0.05），其余時間點比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4和圖3。

圖2 Neuritin在肝組織中的表達 （免疫組織化學法染色×200）

表3 各組不同時間點Neuritin評分比較 （n =6，分，±s）

表3 各組不同時間點Neuritin評分比較 （n =6，分，±s）

注：?與正常組、骨折組比較，P ＜0.05

組別 6 h 12 h 1d 3d 5d 7d 14d肝損傷組 0.73±0.16 1.57±0.23? 2.23±0.29? 3.47±0.33? 4.07±0.30? 2.90±0.27? 1.97±0.23?骨折組 0.43±0.19 0.27±0.20 0.47±0.24 0.60±0.18 0.57±0.29 0.37±0.23 0.43±0.15正常組 0.30±0.11 0.47±0.16 0.43±0.15 0.44±0.16 0.31±0.10 0.27±0.16 0.40±0.17 F值 1.194 71.129 113.611 324.421 420.035 254.788 131.890 P值 0.330 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表4 各組不同時間點HSP60評分比較 （n =6，分，±s）

表4 各組不同時間點HSP60評分比較 （n =6，分，±s）

注：1）與正常組比較，P ＜0.05；2）與骨折組比較，P ＜0.05

組別 6 h 12 h 1d 3d 5d 7d 14d肝損傷組 1.90±0.27 3.10±0.211）2） 3.40±0.281）2） 4.57±0.291）2） 6.10±0.281）2） 4.03±0.291）2） 2.87±0.321）2）骨折組 1.57±0.29 2.53±0.271） 2.90±0.211） 1.56±0.30 1.50±0.21 1.47±0.21 1.67±0.21正常組 1.70±0.21 1.27±0.162） 1.50±0.212） 1.53±0.24 1.60±0.28 1.37±0.23 1.57±0.32 F值 2.452 109.128 103.929 235.374 621.300 223.514 37.381 P值 0.120 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

圖3 HSP60在肝組織中的表達 （免疫組織化學法染色×200）

3 討論

Neuritin最初被認為是一條高度限制在神經系統表達的基因，ZITO等[6]研究發(fā)現，Neuritin基因的過表達增強神經元細胞對神經生長因子（nerve growth fact，NGF）的應答,從而刺激神經元突起的生長及神經元細胞的遷移。在胎鼠腦發(fā)育時期，Neuritin過表達可以阻斷Caspase-3的活性,而抑制皮層細胞的凋亡。Neuritin可以作為NGF共同發(fā)揮作用的下游因子，與神經組織可塑性密切相關[7]。然而隨著研究深入，Neuritin在機體其他組織中也有表達，并介導神經系統外組織的再生，Neuritin促進真皮微血管內皮細胞聚集和增殖，在血管領航和網絡形成中發(fā)揮導向作用[8]。Neuritin與肝損傷修復的研究鮮見報道，日本學者在切除70%小鼠肝臟后，Neuritin在肝臟的表達呈上升趨勢，隨著肝臟再生，Neuritin基因表達也上升[9]。本研究結果也證實，Neuritin在肝臟組織中表達，并且在肝臟損傷后Neuritin表達水平從12 h開始呈先升高后下降的變化趨勢，貫穿于肝臟損傷后的修復進程，而且其表達水平高于骨折組和正常組，因此筆者推定Neuritin參與肝組織的損傷、修復過程，可能對肝細胞的發(fā)育或再生起重要作用，具有潛在的臨床價值。

HSP60是線粒體內最主要的分子伴侶蛋白之一，生理狀況下其主要參與蛋白質的轉運、折疊等。在機體受到損傷時，HSP60作為一種應激蛋白抵御各種損害因素的影響。研究發(fā)現，應激狀態(tài)下HSP60發(fā)揮分子伴侶作用，調節(jié)靶蛋白的活性和功能，從而保護細胞生存[10]。HSP60可以與抗凋亡因子Bcl-XL蛋白相互作用，當激活線粒體凋亡通路時，HSP60過表達可增加Bcl-XL基因的表達，降低促凋亡因子Bax的表達量，從而穩(wěn)定線粒體膜電位，抑制Caspase-3通路激活，減少細胞凋亡[11-12]。HSP60也可能參與肝臟的再生，SHI等[13]研究報道，HSP60在切除2/3小鼠肝臟組織后，修復早期表達升高，從而激活庫普弗細胞表面的Toll樣受體，分泌白細胞介素6、腫瘤壞死因子等細胞因子，在肝臟損傷修復中具有重要作用。本研究發(fā)現，骨折組12 h、1d時 HSP60在肝臟表達量較正常組升高，AST濃度在6 h、12 h、1d時也升高，HSP60在骨折創(chuàng)傷后表達升高可能是作為應激蛋白，抵御骨折創(chuàng)傷帶給肝細胞的危害。而在肝損傷組，HSP60的表達與Neuritin的表達變化趨勢一致，從12 h開始升高，且高于骨折組和正常組，因此筆者認為HSP60可能不僅僅作為一種應激蛋白起防御保護作用，HSP60可能也參與了肝臟的創(chuàng)傷修復過程。

ALT、AST是反映各種功能的經典指標，ALT、AST升高及肝組織切片明確大鼠肝臟損傷，肝臟損傷后肝細胞通過強大的再生能力使自身結構和功能恢復，其修復過程有多種細胞及因子參與。本研究首次證實，Neuritin和HSP60在受損肝組織的時相性表達，都呈先升高后下降的變化趨勢，而且筆者注意到HSP60與Neuritin在機體組織具有共同的作用。兩者都在蛋白質的跨膜轉運起重要作用，都參與細胞周期及凋亡進程，應激狀態(tài)是都可以過表達或異位表達。

綜上所述，推測HSP60和Neuritin都可能參與肝臟的創(chuàng)傷修復過程，兩者作用機制可能是HSP60和Neuritin的過表達及相互作用，調節(jié)細胞周期抑制受損肝細胞凋亡，輔助相關蛋白的跨膜轉運，促進細胞增殖發(fā)育，維持組織可塑性。本研究將為進一步研究Neuritin和HSP60在肝損傷修復過程中的具體作用，以及機制奠定理論基礎，為肝細胞受損后再生修復提供新思路。

[1]IERARDI A M,dUKA E, LUCCHINA N, et al. The role of interventional radiology in abdomino-pelvic trauma[J]. British Journal of Radiology, 2015, 89(1061):dOI: 10.1259/bjr.20150866.

[2]楊安力, 郭志勇, 何曉順. 肝再生過程中信號轉導研究現狀與展望[J]. 中華實驗外科雜志, 2013, 30(10) : 2022-2025.

[3]NEDIVI E, HEVRONId, NAOTd, et al. Numerous candidate plasticity-related genes revealed by differential cDNA cloning[J]. Nature, 1993, 363(6431): 718-722.

[4]羅星, 張峪涵, 于娜, 等. 神經突起因子酵母雙雜交誘餌質粒的構建和轉化[J]. 中國公共衛(wèi)生, 2006, 22(4): 444-445.

[5]陸明, 湯禮軍, 田伏洲, 等. 大鼠肝臟撞擊傷動物模型的制備及評價[J]. 創(chuàng)傷外科雜志, 2010, 12(1): 60-63.

[6]ZITO A, CARTELLId, CAPPELLETTI G, et al. Neuritin 1 promotes neuronal migration[J]. Brain Structure and Function, 2014, 219(1): 105-118.

[7]ZHANG Y, ZHANG S, XIAN L, et al. Expression and purification of recombinant human neuritin from Pichia pastoris and a partial analysis of its neurobiological activity in vitro[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2015, 99(19): 8035-8043.

[8]CARTLEDGE J C, ROLLAND C, LEMERLE S, et al. Novel cellular genes essential for transformation of endothelial cells by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus[J]. Cancer Research, 2005, 65(12): 5084-5095.

[9]KOJIMA N, SHIOJIRI N, SAKAI Y, et al. Expression of neuritinduring liver maturation and regeneration[J]. FEBS Letters, 2005, 579(21): 4562-4566.

[10]CAPPELLO F, MARINO G A, PALUMBO P A, et al. Hsp60 chaperonopathies and chaperonotherapy: targets and agents[J]. Expert Opinion on Therapeutic Targets, 2013, 18(2): 185-208.

[11]SONG E, TANG S, XU J, et al. Lenti-siRNA Hsp60 promote bax in mitochondria and induces apoptosisduring heat stress[J]. Biochemical Biophysical Research Communications, 2016, 481(1/2): 125-131.

[12]GUPTA S, KNOWLTON A A. HSP60, Bax, apoptosis and the heart[J]. Journal of Cellular Molecular Medicine, 2005, 9(1): 51-58.

[13]SHI Q,dONG Z, WEI H. The involvement of heat shock proteins in murine liver regeneration[J]. Cellular Molecular Immunology, 2007, 4(1): 53-57.

Expressions of neuritin and HSP60 in traumatically-injuried liver tissue of rats*

Jiang-wen Wu, Mei-yi Zhu, Jun Ouyang, Tao Zhou,dong Cao

(Department of Emergency Surgery, the First Aff i liated Hospital of Medical College of Shihezi University, Shihezi, Xinjiang 832008, China)

ObjectiveTodetect the expressions of neuritin and HSP60 in traumatic liver tissues of rats at different time, anddiscuss the effect of neuritin and HSP60 on the repair of injuried hepatic tissue.MethodsOne hundred and twenty-six SD rats were randomlydivided into liver injury group (group A), fracture group (group B) and normal group (group C). In each group, the serum concentrations of ALT and AST were respectively measured at seven time points (6 and 12 h, 1, 3, 5, 7 and 14d), HE staining and immunohistochemical method were used todetect the expressions of neuritin and HSP60 in the liver tissue of the rats.ResultsAt the time of 6 h, 12 h and 1d, serum concentrations of ALT and AST in the group A were higher than those in the group B and the group C (P＜ 0.05). The immunohistochemical staining results indicated the expressions of neuritin and HSP60 in the group A at the time points from 12 h to 14d were significantly higher than those in the group B and the group C (P＜ 0.05). The expression of HSP60 in the group B was higher than that in the group C at 12 h and in 1d (P＜ 0.05). And the expressions of neuritin and HSP60 increased at first and thendecreased.ConclusionsThe interaction between neuritin and HSP60 may play an important role in hepatic self-repair after traumatic liver injury.

liver injury; fracture; neuritin; heat shock protein 60

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.02.002

1005-8982（2018）02-0008-06

R575.3

A

2016-11-16

國家自然科學基金（No：81560312）

歐陽軍，E-mail：wenf010@163.com

（童穎丹 編輯）