MMP-7、MMP-9基因多態(tài)性與結直腸癌發(fā)病的關系研究*

魏雙琴，李迎春，張成，徐繼，金麗雯

（上海市浦東新區(qū)健康醫(yī)學院附屬周浦醫(yī)院 消化內科，上海 201318）

MMP-7、MMP-9基因多態(tài)性與結直腸癌發(fā)病的關系研究*

魏雙琴，李迎春，張成，徐繼，金麗雯

（上海市浦東新區(qū)健康醫(yī)學院附屬周浦醫(yī)院 消化內科，上海 201318）

目的探討癌胚抗原（CEA）、糖類抗原199（CA199）、基質金屬蛋白酶-7（MMP-7）-181A/ G、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）P574R基因多態(tài)性與結直腸癌發(fā)病的關系。方法以500例健康體檢志愿者作為研究對象，按血清CEA、CA199水平將其分為高表達組和正常組，并統(tǒng)計結直腸癌的發(fā)病率。采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性方法分析MMP-7基因-181A/G位點、MMP-9基因P574R單核苷酸多態(tài)性分布頻率，分析其與臨床資料關系。結果高表達組結直腸癌發(fā)病率高于正常組（P＜0.05），高表達組MMP-7 GG+AG基因型比例多于正常組（P＜0.05），高表達組中G等位基因頻率高于正常組（P＜0.05），兩組MMP-9 PP、PR+RR基因型表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結直腸癌患者MMP-7 GG+AG基因型頻率高于健康人群（P＜0.05），結直腸癌患者MMP-9 PR+RR、PP基因型頻率與健康人群比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），MMP-7、MMP-9基因多態(tài)性與結直腸癌TNM分期、淋巴結轉移相關（P＜0.05）。結論CEA、CA199對結直腸癌的早期診斷有一定臨床價值，MMP-7基因-181 GG+AG、MMP-9 P574R PP基因型可能與結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關。

基質金屬蛋白酶-7；基質金屬蛋白酶-9；單核苷酸多態(tài)性；結直腸癌

結直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一[1]，大量研究證實結，直腸癌的發(fā)生、發(fā)展與多種基因的突變、DNA異常修復等有關[2-3]。由于飲食習慣和生活環(huán)境的改變，結直腸癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升，有數(shù)據(jù)顯示結直腸癌死亡人數(shù)占癌癥患者死亡的9%[4]，結直腸癌患者就診時，腫瘤已經(jīng)進展至中、晚期，術后5年生存率差強人意，因此結直腸的早期診斷對提高患者生存期至關重要[5]。目前大量研究證實，多種易感基因多態(tài)性與結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關，其中單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是常見的基因多態(tài)性形式之一[6]。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原199（carbohydrate antigen 199，CA199）對結直腸癌的診斷有一定臨床價值。本研究通過體檢篩查發(fā)現(xiàn)CEA、CA199升高的健康人群，檢測結直腸癌基質金屬蛋白酶-7（matrix metalloproteinase-7，MMP-7）、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）基因的多態(tài)性，經(jīng)過隨訪后分析基因多態(tài)性與結直腸癌發(fā)病的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般材料

選取2013年1月-2014年12月上海市浦東新區(qū)周康地區(qū)2個社區(qū)，年齡18～70歲的500例健康體檢人群。利用全自動化學發(fā)光免疫分析法檢測血清CEA、CA199水平，CEA＞5 ng/ml、CA199＞37μ/ml者為高表達組（103例），低于上述水平者為正常組（397例）。其中，高表達組男性65例，女性38例；平均年齡（48.1±8.3）歲。正常組男性214例，女性183例；平均年齡（46.5±7.7）歲。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取收集兩組人群靜脈血2 ml，乙二胺四乙酸抗凝后，使用美國Promega公司W(wǎng)izard GenomicdNAPurification kit試劑盒提取基因組DNA。具體步驟如下：靜脈血標本中加入800μl細胞溶解液，充分混勻后，10 000 r/min離心30 s，棄上清，加入300μl細胞核溶解液，反復吹打后加150μl蛋白沉淀劑，10 000 r/min離心3 min，將上清移至裝有200μl異丙醇的EP管中，上下顛倒混勻，10 000 r/min離心1 min，加入無水乙醇1 ml，10 000 r/min離心5 min后即可得DNA。

1.2.2 易感基因MMP-7、MMP-9多態(tài)性檢測采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragement length polymorphisms，PCRRFLPs）方法，分析MMP-7基因-181A/G位點、MMP-9基因P574R SNPs分布頻率。MMP-7正向引物：5’-TGGTA CCATAATGTCCTGAATG-3’，反向引物：5’-TCGTTATT GGCAGGAAGCACACAATGAATT-3’；MMP-9正向引物：5’-GCTGGACTCGGTCTTTGAGGATC-3’，反向引物：5’-TTGAGCCTCCTTGACTGATGGG-3’。25μl反 應 體系：Taq酶0.15μl，引物各0.5μl，DNA模板1.0μl，Mg2+3μl，脫氧核糖核苷三磷酸2μl，ddH2O補充至25μl。擴增條件：94℃預變性10 min，94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30次循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸5 min，使用限制性內切酶BamHⅠ酶切MMP-7、MMP-9聚合酶鏈反應產(chǎn)物。

1.3 隨訪

隨訪1次/3個月，問卷調查收集人群吸煙、飲酒、排便或大便性狀改變、大便隱血、體重下降等癥狀。檢查電子結腸鏡、超聲內鏡或窄帶成像放大內鏡等1次/6個月，進行結直腸癌的早期診斷。共隨訪2年，統(tǒng)計結直腸癌的發(fā)病率和結直腸癌發(fā)病患者的臨床資料。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，用t檢驗；計數(shù)資料以率表示，用χ2檢驗或Fisher’s確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MMP-7、MMP-9基因型

根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳條帶型，判斷產(chǎn)物基因型：MMP-7基因-181電泳條帶150 bp為AA型，30和120 bp為GG型，30、120和150 bp為AG型；MMP-9 P574R電泳條帶112 bp為RR型，19和93 bp為PP型，19、93和112 bp為PR型。見圖1。

圖1 MMP-7基因-181典型電泳條帶圖

2.2 兩組人口學分布特征

高表達組與正常組在年齡、性別方面比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。兩組在體重指數(shù)（body mass index，BMI）、飲酒史、吸煙、家族史等方面比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。兩組結直腸癌發(fā)病率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組人口學分布特征比較

2.3 高表達組與正常組患者MMP-7、MMP-9基因型分布

103例高表達組中MMP-7 GG+AG基因型占62.1%（64/103），AA基因型占27.9%（39/103），A、G等位基因所占比例分別為41.7%（86/206）和58.3%（120/206）；正常組中MMP-7基因-181A/G位點GG+AG基因型占41.1%（163/397），AA基因型占59.9%（236/397），A、G等位基因所占比例分別為63.5%（504/794）和36.5%（290/794）。高表達組中MMP-7 GG+AG基因型比例高于正常組（χ2=14.97，P=0.000），高表達組中G等位基因頻率高于正常組（χ2=31.92，P=0.000）。高表達組中MMP-9 PP、PR+RR基因型所占比例分別為57.3%（59/103）和42.7%（44/103），P、R等位基因所占比例分別為81.6%（168/206）和18.4%（38/206）；正常組中PP、PR+RR基因型所占比例分別為55.7%（221/397）和44.3%（176/397），P、R等位基因所占比例分別為79.6%（632/794）和20.4%（162/794）。兩組MMP-9 PP、PR+RR基因型表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.086，P=0.768），兩組P、R等位基因表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.153，P=0.695）。

2.4 結直腸癌患者MMP-7、MMP-9基因型分布

高表達組結直腸癌發(fā)病率為12.6%，高于正常組的5.0%（χ2=12.313，P=0.002），33例結直腸癌患者MMP-7 GG+AG、AA基因型分別占72.7%（24/33）和27.3%（9/33），結直腸癌患者GG+AG基因型頻率高于健康人群的39.6%（185/467）（χ2=22.670，P=0.000），結直腸癌患者G等位基因所占比例為66.7%，高于健康人群的34.4%（χ2=13.891，P=0.000）；結直腸癌患者MMP-9 PR+RR、PP基因型分別為69.7%（23/33）和30.3%（10/33），PR+RR基因型頻率與健康人群的65.1%（304/467）比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.288，P=0.591），結直腸癌患者P等位基因所占比例為48.9%，與健康人群P等位基因的47.0%比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.054，P=0.815）。在多因素分析中控制其他變量，分析結直腸癌患者臨床病理參數(shù)與MMP-7、MMP-9基因型的關系，TNM分期與MMP-7 GG+AG、AA基因型有關（P＜0.05），淋巴結轉移患者MMP-7 GG+AG基因型比例高于AA基因型（P＜0.05）；結直腸癌患者MMP-9 PP、PR+RR基因型差異與TNM分期、淋巴結轉移、腫瘤直徑有關（P＜0.05）。見表2。

表2 結直腸癌患者MMP-7、MMP-9基因型分布 （n =33）

3 討論

結直腸癌是胃腸道常見的惡性腫瘤，遺傳異質性、環(huán)境因素、飲食習慣等因素被認為與結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關[7]，其中癌基因和抑癌基因失衡、基因突變、錯配修復基因等遺傳因素的研究對結直腸癌的診療有很重要的臨床價值[8]。SNP是人類基因突變的普遍形式[9]，對SNP與結直腸癌易感性的研究是結直腸癌早期診斷、靶向治療的方向。目前，已發(fā)現(xiàn)多種易感基因多態(tài)性與結直腸癌的發(fā)病密切相關，為結直腸癌的早期診斷和靶向治療提供了新的方向[10-11]。CEA、CA199是診斷結直腸癌常見的腫瘤標志物，血液中CEA、CA199水平升高常提示腫瘤可能存在，然而仍有部分健康人群CEA、CA199表達水平高于醫(yī)學檢測值，但無腫瘤發(fā)生，對這類人群仍需警惕結早期直腸癌的可能性。因此，本研究通過統(tǒng)計分析CEA、CA199高表達人群結直腸癌發(fā)病率，評價MMP-7、MMP-9基因的多態(tài)性與結直腸癌的遺傳易感性。

本研究中高表達組結直腸癌發(fā)病率為12.6%，高于正常組的5.0%，提示CEA、CA199對結直腸癌的早期診斷仍有一定的臨床價值，與既往的研究結果相似[12]。基質金屬蛋白酶是降解細胞外基質的主要蛋白之一，與腫瘤侵襲、轉移等密切相關，既往研究發(fā)現(xiàn)，MMP-7、MMP-9與胃癌、食管癌、結直腸癌等消化系統(tǒng)腫瘤密切相關[13-15]。MMP-7基因定位于11q21-q22，其轉錄起始點上游181 bp處是其發(fā)生多態(tài)性位點的位置，MMP-7基因-181A/G處表達G等位基因時，啟動子的轉錄活性增強，從而導致腫瘤的早期轉移與侵襲[16]。本研究中，高表達組MMP-7 GG+AG基因型表達比例高于正常組，高表達組中G等位基因頻率高于正常組，這可能解釋了CEA、CA199高表達人群結直腸癌發(fā)病率高于正常人群的原因，結直腸癌患者GG+AG基因型頻率多于健康人群，G等位基因所占比例高于健康人群，提示MMP-7基因-181 GG+AG基因型可能增加結直腸癌的發(fā)病風險，與GHILARDI等[17]研究結果相似。有學者發(fā)現(xiàn)，MMP-7基因-181 G等位基因啟動子活性強于A等位基因，MMP-7基因-181G等位基因通過增強MMP-7 mRNA轉錄，使MMP-7蛋白表達增加[18]，而且大量臨床試驗證實MMP-7與結直腸癌的TNM分期、淋巴結轉移有關，本研究也進一步證實MMP-7基因型與TNM分期、淋巴結轉移有關。

MMP-9是含有Ca2+、Ze2+的降解細胞外基質的水解蛋白酶，含有C-1562T、P574R等多個基因多態(tài)性位點，C-1562T、P574R分別位于基因啟動子和蛋白編碼區(qū)域，MMP-9 P574R多態(tài)位點位于第10外顯子區(qū)[19]。有研究結果表明，MMP-9 574P等位基因攜帶者會增加肺癌、胃癌淋巴結轉移風險[20]，但對MMP-9 P574R基因多態(tài)性與結直腸癌易感性的相關性研究，不同學者得出的結論迥異[21-22]。本研究結果表明，高表達組與正常組MMP-9 P574R等位基因表達無差異，但在結直腸癌患者中MMP-9 P574R基因型與腫瘤的TNM分期、淋巴結轉移、腫瘤直徑有關，攜帶P等位基因結直腸癌患者腫瘤更容易發(fā)生侵襲、轉移。本研究不足之處在于隨訪時間僅2年，結直腸癌患者的樣本量只有30多例，未對患者術后生存期、放化療敏感性等臨床資料進行分析，以及未對MMP在結直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的具體機制加以探討，下一步的研究方向將針對這些不足之處予以探討。

綜上所述，CEA、CA199對結直腸癌的早期診斷有一定的臨床價值，MMP-7-181A/G、MMP-9 P574R位點基因多態(tài)性與結直腸癌易感性有關，MMP-7基因-181 GG+AG、MMP-9 P574RPP基因型可能與結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關。

[1]CHEAL S M, XU H, GUO H F, et al. Theranostic pretargeted radioimmunotherapy of colorectal cancer xenografts in mice using picomolar affinity 86 Y- or 177 Lu-DOTA-Bn binding scFv C825/ GPA33 IgG bispecific immunoconjugates[J]. European Journal of Nuclear Medicine Molecular Imaging, 2016, 43(5): 925-937.

[2]HAHN M M, VOER R Md, HOOGERBRUGGE N, et al. The genetic heterogeneity of colorectal cancer predisposition-guidelines for genediscovery[J]. Cellular Oncology, 2016: 1-20.

[3]CATARINELLA M, MONESTIROLI A, ESCOBAR G, et al. IFN gene/cell therapy curbs colorectal cancer colonization of the liver by acting on the hepatic microenvironment[J]. Embo Molecular Medicine, 2016, 31(2): 651-652.

[4]ZAUBER A G, WINAWER S J, O'BRIEN M J, et al. Colonoscopic polypectomy and long-term prevention of colorectal cancerdeaths[J]. New England Journal of Medicine, 2012, 366(6): 687-696.

[5]dU M, LIU S, GUd, et al. Clinical potential role of circulating microRNAs in earlydiagnosis of colorectal cancer patients[J]. Carcinogenesis, 2014, 35(12): 2723-2730.

[6]KAIDONIS G, GILLIES M C, ABHARY S, et al. A singlenucleotide polymorphism in the microRNA-146a, gene is associated withdiabetic nephropathy and sight-threateningdiabetic retinopathy in Caucasian patients[J]. Actadiabetologica, 2016: 1-8.

[7]PONCE C G, BLANCH R S, HERAS B Sd L, et al. Clinical guideline seom : hereditary colorectal cancer[J]. Clinical Translational Oncology, 2015, 17(12): 962-971.

[8]BAENA R, SALINAS P.diet and colorectal cancer[J]. International Journal of Cancer, 2015, 71(Supplement 10): 10-12.

[9]WEISS L A. Autism genetics: emergingdata from genome-wide copy-number and single nucleotide polymorphism scans[J]. Expert Review of Moleculardiagnostics, 2014, 9(8): 795-803.

[10]阮玉鳳, 孫璟, 吳方, 等. COX-2基因多態(tài)性與結直腸癌發(fā)病風險的關系研究[J]. 國際消化病雜志, 2013, 33(4): 260-263.

[11]沈宏, 趙冬雨, 張寧. 修復基因XRCC1 Arg194Trp位點多態(tài)性與結直腸癌易感性的相關性分析[J]. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014(4): 476-478.

[12]鐘武, 張磊昌, 鐘世彪, 等. 結直腸癌患者術前CEA、CA199濃度與臨床病理特征及預后的關系[J]. 中國普通外科雜志, 2015, 24(4): 499-504.

[13]YANG B, SU K, GAO J, et al. Expression and prognostic value of matrix metalloproteinase-7 in colorectal cancer[J]. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention Apjcp, 2012, 13(3): 1049-1052.

[14]LI C Y, YUAN P, LIN S S, et al. Matrix metalloproteinase 9 expression and prognosis in colorectal cancer: a meta-analysis[J]. Tumour Biology the Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology Medicine, 2013, 34(2): 735-741.

[15]LIU Y, LIU H, LUO X, et al. Overexpression of SMYD3 and matrix metalloproteinase-9 are associated with poor prognosis of patients with gastric cancer[J]. Tumour Biology the Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology Medicine, 2015, 36(6): 4377-4386.

[16]莊建新. MMP-7基因多態(tài)性與結直腸癌相關性研究[D]. 南昌:南昌大學醫(yī)學院, 2014.

[17]GHILARDI G, BIONDI M L, ERARIO M, et al. Colorectal carcinoma susceptibility and metastases are associated with matrix metalloproteinase-7 promoter polymorphisms[J]. Clinical Chemistry, 2003, 49(11): 1940-1942.

[18]MORENO-ORTIZ J M, GUTIéRREZ-ANGULO M, PARTIDAPéREZ M, et al. Association of MMP7-181A/G and MMP13-77A/G polymorphisms with colorectal cancer in a Mexican population[J]. Genetics Molecular Research Gmr, 2014, 13(AOP): 3537-3544.

[19]XIN L, HOU Q, XIONG Q I, et al. Association between matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 polymorphisms and endometriosis: a systematic review and metaanalysis[J]. Biomedical Reports, 2015, 3(4): 559-565.

[20]陳健. MMP-9基因多態(tài)性與胃癌關系的研究[D]. 石家莊: 河北醫(yī)科大學, 2011.

[21]YANG Z H, LI S N, LIU J X, et al. MMP-9 polymorphisms are related to serum lipids levels but not associated with colorectal cancer susceptibility in Chinese population[J]. Molecular Biology Reports, 2012, 39(10): 9399-9404.

[22]劉金星. MMP-9基因多態(tài)性與結直腸癌相關性研究[D]. 瀘州:瀘州醫(yī)學院, 2011.

Correlations ofMMP7andMMP9gene polymorphisms with incidence of colorectal cancer*

Shuang-qin Wei, Ying-chun Li, Cheng Zhang, Ji Xu, Li-wen Jin
(Department of Gastroenterology, Zhoupu Hospital of Pudong New Area, Shanghai 201318, China)

ObjectiveTo investigate the associations of CEA, CA199,MMP7gene -181A/G polymorphism,MMP9gene P574R polymorphism with the incidence of colorectal cancer. Methods A total of 500 cases of healthy physical examination were raised anddivided into high-expression group and normal group according to the serum levels of CEA and CA199, and the incidence of colorectal cancer was statisticallydetected. Polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism was used to analyze the frequency ofMMP7gene -181A/G andMMP9gene P574R single nucleotide polymorphisms (SNPs). And the correlations of the SNPs with clinical indexes were analyzed.ResultsThe incidence of colorectal cancer in the high-expression group was higher than that in the normal group (P＜ 0.05) and the patients withMMP7GG +AG genotype were more in the high-expression group than in the normal group (P＜ 0.05). G allele frequency in the high-expression group was higher than that in the normal group (P＜ 0.05). There was no obvious difference in theMMP9PP or PR+RR genotype expression between the two groups (P＞ 0.05). The frequency ofMMP7GG+AG genotype in colorectal cancer patients was higher than that in the healthy people (P＜ 0.05), while the frequency ofMMP9PR+RR or PP genotype was not significantly different between the patients and the healthy people (P＞ 0.05).MMP7andMMP9gene polymorphisms were associated with TNM staging and lymphatic metastasis (P＜ 0.05).ConclusionsCA199 and CEA have some clinical value in earlydiagnosis of colorectal cancer.MMP7-181 GG+AG andMMP9P574R PP genotypes may be related to the occurrence anddevelopment of colorectal cancer.

matrix metalloproteinase 7; matrix metalloproteinase 9; single nucleotide polymorphism; colorectal cancer

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.02.008

1005-8982（2018）02-0042-05

R574

A

2016-08-08

上海市浦東新區(qū)科技發(fā)展基金（No：PKJ2015-Y31）

（童穎丹 編輯）