2017年遼寧省番茄灰霉病菌對腐霉利的抗藥性現狀及機制研究

杜 穎 付丹妮 鄒益澤 白雪松 姜 震 程 功 紀明山祁之秋

（沈陽農業大學植物保護學院，遼寧沈陽 110866）

在農業生產中，由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是一種需要重點防治的真菌性病害，可侵染多種蔬菜和水果，對作物的產量和品質造成嚴重破壞（Jiang et al.，2009；張彩鳳 等，2013；張瑋 等，2013）。由于灰霉病菌的生命周期非常短，孢子產生量大，對防治藥劑極易產生抗藥性（Rosslenbroich & Stuebler，2000），如灰霉病菌對苯并咪唑類、二甲酰亞胺類及氨基甲酸酯類等殺菌劑的抗性已多見報道，抗性問題日趨嚴重（丁中等，2001；趙建江 等，2010；Zhang et al.，2011）。腐霉利屬于二甲酰亞胺類殺菌劑，于20世紀80年代在我國投入使用，雖應用時間較長，但因其防效高、對作物安全等特點，目前依舊作為防治番茄灰霉病的主要藥劑（徐作珽 等，2001；石延霞 等，2016）。其抗性問題在遼寧省也較為突出，農民在使用時往往會加大藥量來提高藥效，而由此造成的農藥濫用問題十分普遍，還會引起農藥殘留的潛在危害（趙曉軍 等，2010；宋晰 等，2013）。

在實際田間生產中，農藥抗性問題復雜多變，需要及時對其進行監測，更新數據，了解抗藥性現狀，以便做出準確全面的評估（Leroux et al.，2002；Ma & Michailides，2005）。鑒于此，本試驗采集了遼寧省8個地區的番茄灰霉病菌的田間種群，系統測定了115株番茄灰霉病單孢菌株對腐霉利的抗藥性，明確了當前遼寧省各地區番茄灰霉病對腐霉利的抗藥性現狀，并探究了抗藥性的分子機制，以期對番茄灰霉病抗藥性治理及田間有效防治提供借鑒，并能指導農民正確施藥，減少抗性藥劑的濫用，推動農藥減施。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試藥劑為95%腐霉利（procymidone）原藥，由沈陽化工研究院有限公司測試與評價中心提供。

供試菌株為番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）：2017年從遼寧省沈陽、普蘭店、盤錦、葫蘆島、朝陽、丹東、法庫、阜新等8個番茄栽培區采集番茄灰霉病病葉和病果，并于實驗室內進行分離、純化和培養，單孢菌株低溫保存于沈陽農業大學農藥學實驗室，共計獲得115株番茄灰霉病單孢菌株。

供試培養基：馬鈴薯瓊脂培養基（PDA）：稱取葡萄糖20 g、去皮馬鈴薯200 g，瓊脂條20 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，煮沸，經紗布過濾后所得液體于121 ℃下經高壓蒸汽滅菌30 min，而后用于番茄灰霉病菌的培養保存以及對腐霉利敏感性的測定。馬鈴薯葡萄糖液體培養基（PD）：稱取葡萄糖20 g、去皮馬鈴薯200 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，煮沸，經紗布過濾后所得液體于121 ℃下經高壓蒸汽滅菌30 min，而后用于番茄灰霉病菌的培養。

1.2 試驗方法

1.2.1 含藥培養基的配制 將腐霉利原藥用丙酮溶解，配制成10 000 mg·L-1的母液，而后逐級稀釋，按一定比例加到滅菌后的培養基中，制成所需濃度的含藥培養基。

1.2.2 番茄灰霉病菌對腐霉利的敏感性測定 采用菌絲生長速率法測定115株番茄灰霉病菌對腐霉利的敏感性：設置6個濃度梯度，以不添加腐霉利原藥為空白對照，將培養后的各菌株取直徑5 mm菌餅接種于含藥培養基平板中央，每處理3次重復，在25 ℃下黑暗培養72 h。測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率，并利用SPSS軟件計算有效抑制中濃度（EC50值）、95%置信限、毒力回歸方程及相關系數（R）。

1.2.3 番茄灰霉病菌對腐霉利抗性指數的測定及其抗性水平的劃分 依據宋晰等（2013）測定的番茄灰霉病菌對腐霉利的敏感基線值（0.31 mg·L-1），對115株番茄灰霉病菌進行抗性指數的測定和抗藥性水平的判別。抗性水平判別依據：當抗性指數（RF）≤5，即菌株的EC50≤1.55 mg·L-1為敏感菌株；當5＜RF≤10，即1.55 mg·L-1＜EC50≤3.10 mg·L-1為低抗菌株；當10＜RF≤40，即3.10 mg·L-1＜EC50≤ 12.40 mg·L-1為中抗菌株；當RF＞40，即EC50＞12.40 mg·L-1為高抗菌株。計算統計各地區番茄灰霉病菌的抗性頻率。

1.2.4 番茄灰霉病菌的DNA提取及PCR反應體系

選取低抗菌株LNFK-1、LNHLD-16，中抗菌株LNSY-1、LNCY-8、LNDD-11、LNPLD-16以及高抗菌株LNPJ-11、LNFX-6作為研究對象。接種菌餅于馬鈴薯葡萄糖液體培養基中，22 ℃、120 r·min-1振蕩培養4 d后去除菌餅，用去離子水沖洗、過濾菌絲，重復沖洗3次，真空抽濾15 min，35 ℃下烘干1 d。將菌絲研磨成粉末。取10 mg菌絲粉采用Omega真菌基因組DNA抽提試劑盒（D3390-01，Omega Bio-tek，美國）進行DNA的提取，并用紫外分光光度計法檢測DNA的濃度和純度。而后根據NCBI的GenBank登記的番茄灰霉病菌（BcOS1）基因序列（AF396827.2），利用Primer premier 5和Oligo 6.0程序設計4對引物（表1），包含了已經在其他植物中報道的2個BcOS1基因位點。并用梯度PCR儀確定每對引物的最佳退火溫度。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 擴增番茄灰霉病菌的引物序列

PCR反應體系（25 μL）：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs（25 mmol·L-1）2.5 μL，hk1F（20 ng·μL-1）2.0 μL，hk1R（20 ng·μL-1）2.0 μL，TaqDNA Polymerase（2 U·μL-1）1.0 μL，DNA Template 1.0 μL以及ddH2O 14.0 μL。擴增反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，在每個引物的最佳退火溫度下退火30 s，72 ℃延伸2 min，共34個循環；最后72 ℃延伸10 min。反應結束后取8 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增效果。若擴增產物電泳條帶清晰，則擴大PCR反應體系至50 μL。擴增產物電泳后，切下目的基因片斷膠，稱量回收膠，用膠回收試劑盒〔Takara Agarose Gel DNA Purification Kit，Ver.2.0，寶生物工程（大連）有限公司〕回收。

1.2.5 測序及序列分析 序列測定采用美國ABI公司的3730XL測序儀和雙脫氧鏈終止法進行，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序。對8個目標菌株進行突變檢測。將序列進行BLAST比對，然后用DNAMAN 8.0軟件對抗藥性和敏感性番茄灰霉病BcOS1基因片段序列進行比對。

2 結果與分析

2.1 遼寧省番茄灰霉病菌對腐霉利的敏感性及抗性指數測定

從表2可以看出，遼寧省8個地區番茄灰霉病菌對腐霉利的EC50值平均為3.99 mg·L-1。在所測菌株中，最高EC50值為16.30 mg·L-1，抗性指數為52.58，已達高抗水平，是最低EC50值0.05 mg·L-1的326倍。抗性指數分布在0.16～52.58之間，平均抗性指數為12.87。

表2 遼寧省番茄灰霉病菌對腐霉利的敏感性

續表

2.2 遼寧省番茄灰霉病菌對腐霉利的抗藥性水平、頻率及分布

從表3可以看出，在115株番茄灰霉病菌菌株中，敏感菌株19株，抗性菌株96株，抗性頻率83.48%。其中低抗菌株為31株，中抗菌株為63株，高抗菌株僅有2株。可見，中抗菌株占比最大，為65.62%。

遼寧省不同地區番茄灰霉病菌對腐霉利的抗藥性存在差異（表3），其中5個地區的番茄灰霉病菌對腐霉利的抗藥性頻率超過了80%。沈陽地區的抗性問題最為嚴重，抗性頻率高達100.00%；而法庫地區的抗性頻率最低，僅為53.33%，在所檢測到的8株抗性菌株中，有7株為低抗菌株，僅有1株為中抗菌株。大部分地區的抗性菌株都以中抗菌株為主，僅在盤錦和阜新所采集的番茄灰霉病菌菌株中各檢測到1株高抗菌株。

2.3 番茄灰霉病菌對腐霉利的抗藥性分子機制

用4對引物擴增番茄灰霉病菌不同種群基因組DNA，分別得到大約1 719、972、707、1 630 bp的4個片段（圖1）。隨后進一步測定了8個抗性菌株的基因序列，在NCBI中與已經登記的番茄灰霉病菌灰葡萄孢組氨酸激酶基因（BcOS1）進行BLAST比對，其序列同源性達到98%，證實這段序列正是BcOS1序列。根據已報道的BcOS1基因序列設計特異引物，經PCR擴增和測序，8個腐霉利抗性菌株組氨酸激酶基因序列全長為5 675 bp，編碼1 315個氨基酸。其中保守區域有2 180 bp，編碼619個氨基酸；非保守區域有3 495 bp，編碼696個氨基酸。對灰葡萄孢野生敏感菌株和野生抗二甲酰亞胺類藥劑菌株的雙組分組氨酸激酶基因（BcOS1）進行比較發現（圖2），在測定的所有樣本中，第369位氨基酸都由谷氨酰胺突變成脯氨酸，第373位氨基酸由天冬酰胺突變成絲氨酸，所選抗性菌株的BcOS1基因均發生了雙位點突變。

表3 遼寧省番茄灰霉病菌對腐霉利的抗性及抗性頻率

圖1 番茄灰霉病抗腐霉利菌株BcOS1基因擴增結果

圖2 抗藥種群番茄灰霉病菌BcOS1基因片斷及其氨基酸殘基的比對

3 結論與討論

番茄灰霉病菌一直是番茄生產中需要重點防治的高風險病菌，病害的發生也往往會對種植者造成重大的經濟損失。特別是隨著設施農業的發展，溫室環境更有利于病菌的滋生，為病害的發生提供了有利條件，近幾年番茄灰霉病也呈現出加重的趨勢（姚士桐 等，2011）。當前，番茄灰霉病的防治主要還是依靠化學防治，特別是當病害大面積暴發時，化學藥劑依然是應對問題的首選（趙楊 等，2014）。但由于灰霉病菌變異快、產孢量大、易傳播等特點，對各類防治藥劑較易產生抗藥性，且目前以腐霉利、嘧霉胺為代表的防治番茄灰霉病的主要藥劑使用年限都已較長，抗藥性問題也較為普遍，在實際應用中就會存在種植者肆意加大用藥量，濫用藥劑的情況（喬廣行 等，2013）。所以在當前形勢下，為應對國家農藥減施的要求，明確番茄灰霉病菌的抗藥性現狀，對指導農民合理施藥，制定病害的防治措施都有重要意義。

本試驗測定了2017年采自遼寧省沈陽、普蘭店、盤錦、葫蘆島、朝陽、丹東、法庫、阜新等8個地區的115株灰霉病菌菌株對腐霉利的敏感性，依據宋晰等（2013）建立的番茄灰霉病菌對腐霉利的敏感基線，明確了遼寧省番茄灰霉病菌對腐霉利的抗藥性現狀，統計分析了其抗性頻率及分布。結果表明，遼寧省番茄灰霉病菌對腐霉利的抗性頻率高達83.48%，抗藥性已十分普遍。在前人的研究中，遼寧省灰霉病菌對腐霉利的抗性頻率低，且多以低抗菌株為主（張傳清 等，2006；劉妍，2015），本試驗結果表明，遼寧省番茄灰霉病菌對腐霉利的抗藥性呈現加重的趨勢，抗性菌株由以前的低抗菌株為主發展到現在中抗菌株占據主體地位，且在部分地區發現了高抗菌株。而遼寧省不同地區番茄灰霉病菌對腐霉利的抗藥性情況也存在差異，沈陽地區的番茄灰霉病菌對腐霉利的抗藥性最為普遍，抗性頻率達到了100%，而盤錦地區番茄灰霉病菌對腐霉利的抗藥性則最為嚴重，其平均EC50值為6.18 mg·L-1，抗性指數平均值高達19.92。

目前，與灰霉病菌對二甲酰亞胺類抗藥性相關的BcOS1基因可在第365、368、369、373位4個氨基酸位點發生突變，已報道的突變類型有7種（詹家綏 等，2014；張鑫和馬雪梅，2014），大多的抗性菌株只在1個位點發生突變，雙位點同時發生突變 的較 少（Ma et al.，2007；Banno et al.，2008）。但在本試驗中，對隨機選取的8個抗性菌株進行分子檢測及基因序列分析時發現，所有抗性菌株BcOS1基因的第369位和第373位氨基酸均同時發生突變，引起這一特征的原因尚不清楚，推測可能與地區環境和用藥特點有關。如果這一推論得到證實，能否在病原菌外部環境與其內在基因突變之間建立某種直接的聯系，以便直接根據地區的具體狀況來推斷該地區病菌發生何種突變，但這種猜想的具體驗證還尚待大量研究（Ma & Michailides，2005）。

綜上，在應對番茄灰霉病時，遼寧省應適當限制腐霉利的應用，以避免抗藥性的進一步加重。而引進新型殺菌劑與生物農藥，輪換使用嘧菌酯、嘧霉胺等不同類別的化學藥劑進行灰霉病防治，也有助于控制番茄灰霉病菌抗藥性的發展。從長遠來看，則需要進一步加強番茄灰霉病菌抗藥性的監測和治理，開發灰霉病防治的綜合技術，擺脫該類病害防治對化學藥劑的過度依賴，從根源上解決抗藥性問題，響應國家農藥減施的發展要求，推動農業的可持續發展。

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