北京地區(qū)萵苣中番茄斑萎病毒的鑒定

陳東亮李明遠(yuǎn)李雪梅王玲玲，4黃叢林*

（1北京市農(nóng)林科學(xué)院，北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京 100097；2北京市功能花卉工程技術(shù)研究中心，北京 100097；3農(nóng)業(yè)基因資源與生物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗室，北京100097；4西藏農(nóng)牧學(xué)院，西藏林芝860000）

萵苣（Lactuca sativaL.）是一種世界性的蔬菜，也是我國最常見的蔬菜種類之一，在我國南北各地廣泛栽植，是一種非常重要的經(jīng)濟(jì)作物。病毒病是萵苣生產(chǎn)過程中常見的病害，由于其發(fā)病快、防治難，往往造成巨大損失。目前已知有十余種植物病毒可以為害萵苣（Moreno & Fereres，2012；Ciuffo et al.，2016），其中番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）由于傳播范圍廣、防治困難而日益成為萵苣生產(chǎn)中危害嚴(yán)重的病害之一。

TSWV為布尼亞病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒屬（Tospovirus），已知至少可以感染84個科的1 090種植物，是目前已知的寄主范圍最廣的植物病毒之一（Parrella et al.，2003）。TSWV危害巨大，對一些農(nóng)作物甚至?xí)斐蓺缧缘膿p失，是辣椒（Capsicum annuum）、番茄（Lycopersicon esculentum）、 煙 草（Nicotiana tabacum）、 菊 花（Chrysanthemum morifolium）等經(jīng)濟(jì)作物重點(diǎn)防疫的病害。自1915年在澳大利亞發(fā)現(xiàn)至今，TSWV已傳播到了全球大部分國家，成為一種全球性的植物病害。

1986年，首次在我國境內(nèi)發(fā)現(xiàn)TSWV（許澤永 等，1986），隨后的十幾年其傳播范圍主要集中于云南、四川及廣東部分地區(qū)（蘇大昆 等，1987；許澤永 等，1989；姚革，1992），并未發(fā)展為全國性的病害。與此同時，我國也將TSWV列入了《進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》，加強(qiáng)了入境植物該病毒的檢疫防疫工作，有效防止了TSWV進(jìn)一步的擴(kuò)散。但近幾年，伴隨國外引種和國內(nèi)資源的流通，TSWV擴(kuò)散速度加快，天津、北京、山東、海南等地均報道發(fā)現(xiàn)TSWV（李飛 等，2012；邱樹亮 等，2012；高葦 等，2016；車海彥 等，2017；李潔 等，2017）。

2017年3月，筆者在北京市順義區(qū)發(fā)現(xiàn)溫室內(nèi)栽培的萵苣疑似發(fā)生了嚴(yán)重的病毒病。經(jīng)RT-PCR檢測、序列測定與生物信息學(xué)分析，證實(shí)其病原物為TSWV。進(jìn)一步基于TSWV核殼體（nucleocapsid protein，NP）基因序列構(gòu)建了國內(nèi)外不同地區(qū)TSWV的系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析了不同國家、不同地區(qū)間TSWV的進(jìn)化關(guān)系，為進(jìn)一步研究TSWV傳播機(jī)制、制定防控措施奠定了基礎(chǔ)。

表1 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹使用的TSWV NP基因序列信息

1 材料與方法

1.1 樣品采集及薊馬的檢測

2017年4月，于北京市順義區(qū)北郎中村種植萵苣的溫室內(nèi)采集具有葉片黃化褪綠、枯死、矮化等癥狀的萵苣葉片，用干凈的保鮮袋包裹后放置于冰盒中，帶回北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心實(shí)驗室，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。同時，收集病害溫室?guī)в兴E馬的萵苣葉片，裝入保鮮袋后帶回實(shí)驗室，于顯微鏡下觀察薊馬蟲體特征。

1.2 TSWV特異序列的克隆

病樣總RNA的提取使用全式金RNA提取試劑盒。采用Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備樣品cDNA。利用Primer STAR高保真酶（Takara）進(jìn)行TSWVNP基因特異序列的擴(kuò)增，引物設(shè)計和RT-PCR反應(yīng)程序參考Chung等（2006）的方法。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，純化回收并連接于克隆載體pGEM-T easy（Promega，USA），熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，挑取陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3 序列分析與進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用DNASTAR軟件進(jìn)行序列的拼接和初步處理。利用MEGA 4軟件，采用鄰接法（neighbour joining）構(gòu)建不同來源TSWVNP基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建使用的其他TSWVNP序列均下載自美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI） 數(shù) 據(jù) 庫， 序列GenBank登錄號、發(fā)生地區(qū)、寄主等信息如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害調(diào)查

感病萵苣主要表現(xiàn)為：葉片斑駁褪綠，植株矮化，生長緩慢，部分肉質(zhì)莖部有明顯條狀黑斑，嚴(yán)重時整株死亡（圖1）。這與最近云南地區(qū)報道的TSWV引起的萵苣類蔬菜病害特征類似（鄭寬瑜等，2015）。經(jīng)初步統(tǒng)計，溫室內(nèi)具有明顯褪綠發(fā)黃、矮化等病癥的萵苣植株達(dá)到25%以上。與此同時，溫室內(nèi)伴有薊馬的大量發(fā)生，經(jīng)顯微鏡下觀察鑒定為西花薊馬（Frankliniella occidentalis）（圖2）。西花薊馬為入侵物種，近幾年在國內(nèi)多地大面積暴發(fā)，造成嚴(yán)重?fù)p失，同時西花薊馬還是TSWV最主要的傳播介質(zhì)?；诓『μ卣骱臀骰ㄋE馬的發(fā)生，初步推測此次發(fā)現(xiàn)的萵苣病害是由TSWV引起的病毒病。

圖1 感病萵苣病害癥狀

圖2 萵苣上發(fā)現(xiàn)的西花薊馬

2.2 RT-PCR檢測

利用TSWV特異引物，對發(fā)病溫室采集的7個表型明顯的萵苣樣本進(jìn)行RT-PCR檢測。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測（圖3），7個樣本均在預(yù)期位置出現(xiàn)了清晰的條帶；以無菌水為模板的陰性對照未出現(xiàn)該條帶，表明這7個樣品均受到TSWV的侵染。

圖3 TSWV的RT-PCR檢測結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收純化，連接到克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，每個樣本取3個克隆進(jìn)行測序。共得到2條大小為777 bp的高度保守序列（BLZ01和BLZ02），2條序列間存在2個堿基的差異。NCBI BLASTN分析顯示，這2條序列與已報道的TSWVNP基因序列高度相似，一致性高達(dá)98%～99%，其中與西班牙分離的TSWVNP基因（GenBank登錄號：FR693152）一致性最高，僅相差2～4個堿基。將這2個基因序列在NCBI進(jìn)行登錄，登錄號分別為MF139144和MF139145。RTPCR檢測和測序結(jié)果進(jìn)一步證明了本次發(fā)現(xiàn)的萵苣病害的病原為TSWV。

2.3 不同來源TSWV的遺傳多樣性分析

基于NP基因序列，構(gòu)建本試驗分離的萵苣TSWV與國內(nèi)外其他地區(qū)已知TSWV的系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖4可知，國內(nèi)已報道的其他地區(qū)分離的TSWV明顯聚集在一起，并進(jìn)一步與日本、韓國的部分TSWV株系聚合在一起，表明中國早期TSWV可能由日本、韓國等地傳入，之后在云南、重慶等地逐漸擴(kuò)散。本試驗中分離鑒定的萵苣TSWV與國內(nèi)已報道株系差異較大，而與西班牙等國外株系聚合較緊密，表明本次發(fā)現(xiàn)的萵苣TSWV并非由云南、重慶等國內(nèi)地區(qū)傳入，很有可能是由國外直接傳入北京的。

圖4 基于NP基因序列的TSWV系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 結(jié)論與討論

TSWV寄主范圍廣泛，甚至能侵染一些常見的田間雜草，從而使得病源清除困難、傳播速度快、防治困難。自1915年首次發(fā)現(xiàn)，TSWV已擴(kuò)散到了全球大部分國家和地區(qū)，是名副其實(shí)的全球性植物病害，被列為世界十大植物病害之一。TSWV主要通過薊馬傳播，薊馬生活周期短、繁殖速度快、寄主范圍廣、適宜性強(qiáng)、極易形成抗藥性，防治難度較大。其中，西花薊馬是TSWV最高效的傳播媒介。西花薊馬在我國也屬于國外入侵的有害生物，同時也是我國入境檢疫的有害生物，國內(nèi)最早關(guān)于西花薊馬的報道見諸于2003年（張友軍 等，2003）。近幾年，西花薊馬在我國大面積暴發(fā)，已成為部分地區(qū)常見的蟲害（張友軍 等，2011）。西花薊馬的擴(kuò)散也加速了TSWV的傳播，本試驗中發(fā)現(xiàn)TSWV的溫室及其周邊長期存在薊馬為害，經(jīng)顯微鏡下觀察確定為入侵物種西花薊馬，西花薊馬可能是本次TSWV暴發(fā)的主要媒介。

病毒病一旦感染極難防治。為了及時發(fā)現(xiàn)、盡早防治，研究人員開發(fā)了多種針對TSWV快速檢測的方法，比如酶聯(lián)免疫法（Sherwood et al.，1989）、電鏡檢測法（張仲凱 等，2004）、LAMP 法（Wu et al.，2016）、RT-PCR 法（Pappu et al.，1996）等。其中，RT-PCR法由于操作簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測速度快、成本低等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于植物病毒的快速檢測。本試驗結(jié)合病癥特征和RTPCR檢測，確診了是由TSWV引起的北京順義萵苣病害。同時，基于TSWV NP基因序列，對國內(nèi)外TSWV的遺傳多樣性進(jìn)行分析，從系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出，發(fā)生在我國云南、廣州等地的TSWV親緣關(guān)系都比較近，且與韓國、日本等國的部分株系表現(xiàn)出較近的關(guān)系，表明我國南方、西南地區(qū)的TSWV可能最早是由韓國、日本等地傳入的。這與20世紀(jì)80年代、90年代昆明、廣州等地大力發(fā)展花卉種植產(chǎn)業(yè)，自日本、韓國引進(jìn)優(yōu)良花卉品種的歷史背景相符合。本試驗中分離的TSWV與我國已知的TSWV親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而與西班牙等國外報道的株系在進(jìn)化關(guān)系上較為接近，表明本次發(fā)現(xiàn)的TSWV極可能是在引種過程中直接從國外帶入的新病毒株系。近幾年，國內(nèi)外品種交流愈加頻繁，也增大了有害生物隨之帶入的風(fēng)險。本試驗在北京地區(qū)首次報道TSWV為害重要經(jīng)濟(jì)作物萵苣，也為進(jìn)一步加強(qiáng)TSWV的檢疫、防疫工作敲響了警鐘。

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