“乳癌術后方”拮抗乳腺癌三苯氧胺治療耐藥的體外實驗研究

陸 清 薛曉紅

（上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院乳腺病科，上海200437）

乳腺癌發病率逐年上升，目前乳腺癌的治療主要包括手術、放化療、內分泌治療、靶向治療及中醫中藥治療，其中內分泌治療是激素受體陽性乳腺癌患者重要的全身治療手段之一。三苯氧胺（又名他莫昔芬，tamoxifen，TAM）是絕經前激素受體陽性乳腺癌患者術后輔助內分泌治療的首選藥物，但TAM耐藥現象限制了療效。前期臨床研究發現，乳癌術后方能降低乳腺癌患者術后的5年復發轉移率[1]，提高5年的無病生存率以及總生存率[2]。為初步探討乳癌術后方在拮抗乳腺癌TAM耐藥中的作用，本研究構建乳腺癌TAM耐藥細胞株（MCF-7/TAM），予不同含藥動物血清干預后，以噻唑藍（MTT）法觀察各組含藥血清對MCF-7/TAM細胞株的生長抑制作用。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞與動物 人乳腺癌細胞株（MCF-7）由美國ATCC細胞保存中心提供；SD大鼠由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，合格證編號：2008001667161，體重（180±20）g，雌性，12只。

1.2 藥物與試劑 青霉素溶液、鏈霉素溶液、RPMI-1640培養基購自美國GIBCO公司；二甲基亞砜（DMSO）購自上海久億化學試劑有限公司；噻唑藍（MTT）購自美國AMRESCO公司；TAM由復旦復華藥業有限公司生產，批號：161201；乳癌術后方（黃芪、黨參、炒白術、茯苓、南沙參、枸杞子、仙靈脾、肉蓯蓉、巴戟天、石見穿、莪術、蜂房），藥物飲片來源于上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院中藥房。

1.3 儀器 超凈工作臺（蘇州凈化）；二氧化碳（CO2）培養箱（日本三洋公司）；生物倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；臺式低速離心機（上海醫療器械股份有限公司醫療設備廠）；通風櫥（蘇州億達公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；振蕩器（上海滬西分析儀器廠）；立式壓力鍋（上海博訊公司）；電熱鼓風干燥箱（上海圣欣公司）；分析天平（德國賽多利斯公司）；酶標儀（北京百泰克生物技術有限公司）；紫外光度儀、分光光度計（日本島津公司）；高速冷凍離心機（德國艾本德公司）；臺式恒溫振蕩器（上海精宏實驗設備有限公司）。

2 實驗方法

2.1 建立耐TAM細胞株（MCF-7/TAM） 人乳腺癌細胞MCF-7在常規加有10%進口胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基中，37℃恒溫、5%CO2培養。以終濃度為5×10-6mol/L的TAM培養基沖擊處于對數生長期的MCF-7細胞，培養24h后棄去含藥培養基，胰酶消化，以1×105/mL細胞濃度接種于新培養瓶中，次日換液，待其逐漸長至70%～80%滿瓶時再次沖擊，如此反復沖擊，持續培養6個月以上，并同時進行抗藥性檢測，反復凍存、復蘇、觀察細胞株的穩定性。

2.2 MTT法檢測細胞耐藥性 細胞消化、計數，配制成濃度為3×104個/mL的細胞懸液，96孔細胞培養板中每孔加入100μL細胞懸液（每孔3×103個細胞）。96孔細胞培養板置于37℃、5%CO2培養箱中培養24h，用完全培養基稀釋TAM至所需濃度，每孔加入100μL相應的含藥培養基，同時設立陰性對照組、陽性對照組。96孔細胞培養板置于37℃、5%CO2培養箱中培養72h，進行MTT染色，λ=490nm，測定OD值，計算各組抑制率。通過各組抑制率應用SPSS 17.0概率單位加權回歸法計算半抑制濃度（IC50）。

2.3 制備大鼠含藥血清 取雌性SD大鼠12只，進行卵巢去勢手術。手術1周后，將大鼠隨機分為對照組、TAM組、中藥組和TAM+中藥組，每組3只。

取乳癌術后方藥物（黃芪30g，黨參12g，炒白術9g，茯苓12g，南沙參15g，枸杞子15g，仙靈脾15g，肉蓯蓉12g，巴戟天12g，石見穿30g，莪術30g，蜂房12g），按照人與大鼠等效劑量的換算系數為6（按照人體重60kg，大鼠0.2kg）計算，大鼠等效劑量=臨床常用量（g/kg）×6。課題組前期實驗證實，乳癌術后方2倍劑量對乳腺癌耐藥細胞的抑制作用最佳，所以計算出的大鼠所需藥物總量要乘以2。將中藥按此藥量配備，一起置于煎煮容器內，加相當于藥材5倍量的冷水浸泡2h，煎煮30min后過濾，藥渣再加3倍量的水，繼續煎煮30min后過濾，合并2次中藥濾液，于旋轉蒸發儀上濃縮。配置TAM，0.1mg/mL。

對照組大鼠灌胃生理鹽水，TAM組大鼠灌胃TAM水溶液，中藥組大鼠灌胃中藥煎劑，TAM+中藥組大鼠灌胃TAM水溶液+中藥煎劑。各藥物用量均為2mL/次，2次/d，連續3d。于末次灌胃后1h，腹主動脈取血，分離血清，經56℃、30min滅活后，過濾除菌，-80℃保存。

2.4 MTT法測定各組藥物對MCF-7/TAM細胞株的抑制作用 細胞消化、計數、配制成濃度為3×104個/mL的細胞懸液，96孔細胞培養板中每孔加入100μL細胞懸液（每孔3×103個細胞）；將96孔細胞培養板置于37℃、5%CO2培養箱中，次日按照組別加入相應的藥物血清，然后分別培養2、4、6、8、10d；將96孔板進行MTT染色，λ=490nm，測定OD值；根據實驗結果，以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

2.5 統計學方法 多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK法，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 MCF-7/TAM細胞系的建立及其耐藥性 MCF-7細胞呈多邊形，貼壁生長，2～3d傳代1次；MCF-7/TAM細胞呈多邊不規則形，貼壁生長，2～3d傳代1次。見圖1。通過MTT法測得不同濃度TAM作用下MCF-7、MCF-7/TAM的抑制率，見圖2。應用SPSS 17.0通過概率單位加權回歸法（Bliss法）計算IC50，得MCF-7/TAM細胞的耐藥指數為8倍（見表1）。

圖1 MCF-7、MCF-7/TAM細胞形態（×100）

圖2 TAM對MCF-7、MCF-7/TAM體外增殖的抑制作用

表1 TAM對MCF-7、MCF-7/TAM體外增殖的半抑制濃度（IC50）及耐藥指數

3.2 MTT法觀察各組含藥血清對MCF-7/TAM細胞株的抑制情況 以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制細胞生長曲線，見圖3。數據及統計學比較見表2。培養2d時，各組細胞OD值比較均無統計學差異（P＞0.05）；4d時TAM組、TAM+中藥組細胞OD值明顯低于對照組（P＜0.05），TAM組和TAM+中藥組間比較差異無統計學意義（P=0.310），中藥組與對照組比較差異無統計學意義（P=0.120）；培養6、8、10d時TAM+中藥組、TAM組、中藥組OD值均明顯低于對照組（P＜0.05），且TAM+中藥組、TAM組、中藥組OD值依次增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。此結果說明隨著培養時間的延長，中藥逐漸發揮作用，其與TAM連用較單用藥組更能抑制MCF-7/TAM細胞的生長。

圖3 以時間為橫坐標、OD值為縱坐標繪制的細胞生長曲線

表2 各組MCF-7/TAM細胞經不同藥物處理后各時間點OD值比較

4 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一[3]，每年全世界約有130萬人被診斷為乳腺癌，約40萬人死于該病。約50%的絕經前激素受體陽性乳腺癌患者出現對TAM的原發性抵抗，30%至40%的患者在治療期間出現繼發性抵抗[4]，大大限制了TAM的應用，不利疾病的治療。目前認為與TAM耐藥有關的機制較多[5-7]，但西醫針對不同生物靶目標的抑制劑目前仍處于基礎研究階段，臨床上缺乏有效的逆轉TAM耐藥的藥物。有學者發現中藥復方與TAM聯合應用有協同作用[8-10]。另有學者研究發現，疏肝益腎方可抑制TAM耐藥的人乳腺癌細胞株（MCF-7）的增殖[11]，增強乳腺癌耐藥細胞對TAM的敏感性[12]。樸瑩等[13]通過實驗研究證明中藥人參皂苷Rg3具有延緩乳腺癌發生TAM耐藥的功效。

陸德銘教授認為，乳腺癌的發生與正氣不足、邪毒留滯有關[14]，又將乳腺癌術后復發轉移原因歸納為氣陰兩虛、沖任失調、余毒未盡，并以扶正祛邪為法則組成了乳癌術后方。方中黃芪、黨參益氣扶正，茯苓、白術健脾益氣，南沙參、枸杞子滋陰益腎，仙靈脾、肉蓯蓉、巴戟天溫腎助陽，莪術、石見穿、蜂房活血解毒。全方具有益氣養陰、調攝沖任、活血解毒作用。實驗研究提示此方有抑制乳腺癌生長轉移的作用[15]。但乳癌術后方是否通過拮抗TAM耐藥提高臨床療效目前尚未有研究涉及。本研究結果發現，隨著培養時間的延長，中藥乳癌術后方逐漸發揮拮抗TAM耐藥的作用，其與TAM聯用較單用TAM更能抑制MCF-7/TAM細胞的生長，提示乳癌術后方與TAM聯用對乳腺癌TAM耐藥細胞株有協同作用。但本實驗只進行了體外研究，下一步將建立裸鼠移植瘤模型，進行體內實驗，進一步驗證乳癌術后方拮抗乳腺癌TAM耐藥的作用，并進行相關機制的探討，以為中醫藥防治乳腺癌提供有力的依據。

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