色素上皮來(lái)源因子促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞增殖機(jī)制初探

晶狀體上皮細(xì)胞(lens endothelial cells,LECs)在晶狀體細(xì)胞的生長(zhǎng)和衰老過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用，與白內(nèi)障的起因和發(fā)展過(guò)程息息相關(guān)。LECs的這種行為通過(guò)許多的細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行分子調(diào)節(jié)[1，2]。色素上皮來(lái)源因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)是一種在人體內(nèi)廣泛存在的細(xì)胞因子。前人研究表明PEDF和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)有拮抗作用[3，4]。在人的房水和LECs中PEDF的水平與人體衰老和白內(nèi)障的發(fā)病程度有正相關(guān)性[5-7]。但是，PEDF是否對(duì)LECs的生長(zhǎng)起調(diào)節(jié)作用，以及相關(guān)的分子機(jī)制還未有報(bào)道。本文著力于闡明PEDF對(duì)LECs生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用以及體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的相關(guān)分子機(jī)制研究。

資料與方法

一、對(duì)象

82例(82只眼)白內(nèi)障患者的納入準(zhǔn)則：(1)年齡52～92歲；(2)非先天性白內(nèi)障，非代謝性白內(nèi)障，非繼發(fā)性白內(nèi)障；(3)眼底病變、葡萄膜炎、青光眼；(4)無(wú)眼外傷和眼內(nèi)手術(shù)史；(5)晶狀體前囊混濁；(6)無(wú)其他晶狀體混濁，除非與年齡有關(guān)的晶狀體混濁。

晶狀體上皮細(xì)胞系HLE-B3培養(yǎng)：完全培養(yǎng)基+10%胎牛血清，80%密度時(shí)胰酶消化，傳代和凍存。

二、方法

1.RT-PCR檢測(cè)PEDF mRNA表達(dá)：白內(nèi)障摘除術(shù)，獲取晶狀體上皮細(xì)胞，接種在培養(yǎng)瓶中。HE染色后檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)密度，分為低密度組(<4000/mm2)和高密度組(>4500/mm2)，每組20例。利用RT-PCR試劑盒提取晶狀體囊膜組織中RNA并合成cDNA。PEDF和β-actin的引物設(shè)計(jì)如表1。采用半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)擴(kuò)增mRNA，分析電泳圖及擴(kuò)增片段，計(jì)算PEDF和mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 PEDF和β-actin引物

2.Annexin V法檢測(cè)LECs增殖和凋亡：加PEDF實(shí)驗(yàn)組：DMEM完全培養(yǎng)基+10%FBS+50ng/ml PEDF，培養(yǎng)72 h。不加PEDF對(duì)照組：DMEM完全培養(yǎng)基+10%FBS。采用annexin V-FITC/7-AAD復(fù)染法檢測(cè)兩組的細(xì)胞周期和凋亡情況。

重懸收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，0.5×106～1×106，一管細(xì)胞懸液中加100 μl緩沖液和100 μl Annexin V-FITC避光孵育，另一管細(xì)胞懸液中加400 μl緩沖液和5 μl 7-ADD溶液，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡情況?！?br>