腺苷酸活化蛋白激酶在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)

師忠芳，徐立新，閆旭，董麗萍，袁芳

缺血性腦損傷的主要發(fā)生機(jī)制之一是能量代謝障礙，腦損傷后神經(jīng)元利用葡萄糖產(chǎn)生三磷腺苷（adenosine triphosphate，ATP）能力減低，轉(zhuǎn)而由星形膠質(zhì)細(xì)胞為其提供乳酸作為能量底物[1]。有研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體氧化磷酸化作用，增加有氧糖酵解產(chǎn)生乳酸[2]。腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphateactivated protein kinase，AMPK）是機(jī)體重要的能量感受器，AMPK激活后增加脂肪酸氧化和糖酵解[3]。大量研究顯示缺血性腦損傷后AMPK被激活對神經(jīng)元產(chǎn)生重要影響[4-6]，AMPK在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的作用研究較少。AMPK由不同亞基形成至少12種異源三聚體發(fā)揮其生物學(xué)功能，但是星形膠質(zhì)細(xì)胞中以何種三聚體存在沒有相關(guān)報(bào)道，本文擬利用培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞檢測AMPK各亞基的表達(dá)情況探討其在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的異源三聚體形式，為進(jìn)一步深入研究AMPK在缺血性腦損傷的發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及試劑 新生1 d的Wistar大鼠由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所[合格證號：SCSK（京）2005-0013]提供。實(shí)驗(yàn)過程按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷，并通過北京市神經(jīng)外科研究所動(dòng)物福利倫理審查（No.201401007）。最低必需培養(yǎng)基（minimum essential medium，MEM）（Gibco，Grand Island，NY，USA）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Gibco）、胰蛋白酶（Merck，Darmstadt，Germany）、兔抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗體（Dako Glostrup，Denmark）、小鼠抗大鼠S100β多克隆抗體（Abcam，Cambridge，UK）、Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG及Alexa Fluor 546標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）、含4'6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI）的熒光封片劑（中杉金橋）、EastepTM總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）提取試劑盒（Promega，Madison，WI，USA）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega）、2×EasyTaq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，GoldViewTM核酸染料及脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）marker購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)參考McCarthy的方法并加以改良[7]，無菌條件下，取新生1 d的Wistar乳鼠大腦皮層組織，將其切割成約1 mm3小塊，吹打過濾后，接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，每3～4 d換液1次。原代培養(yǎng)約10 d后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，經(jīng)過大約10 d進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，GFAP和S100β免疫細(xì)胞熒光染色鑒定培養(yǎng)細(xì)胞純度。

1.2.2 GFAP和S100β免疫熒光染色 根據(jù)師忠芳已發(fā)表文獻(xiàn)的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[7]，培養(yǎng)細(xì)胞丙酮固定30 min，正常羊血清封閉15 min，加入兔抗大鼠GFAP抗體（1∶50），小鼠抗大鼠S100β抗體（1∶100），陰性對照用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗，4℃過夜。Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG及Alexa Fluor 546標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1∶100）避光孵育3 h，含DAPI的熒光封片劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測AMPK各亞基表達(dá) 使用EastepTM總RNA提取試劑盒提取培養(yǎng)細(xì)胞總RNA，應(yīng)用Promega公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，然后進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。按照GenBank大鼠AMPK各亞基序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表1），由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系包括：2×EasyTaq PCR SuperMix 10 μl，上游引物、下游引物各1 μl，模板cDNA 1 μl，無核酸酶的水7 μl，反應(yīng)體系共20 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸25 s，40個(gè)循環(huán)，72℃終延伸7 min。陰性對照為只加入引物不加入模板。整個(gè)PCR反應(yīng)過程在PCR系統(tǒng)（美國Life Technologies，型號Proflex）內(nèi)完成。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad，型號 ChemiDocTMMP）觀察，拍照，分析AMPK各亞基的表達(dá)情況。該實(shí)驗(yàn)分別在3次獨(dú)立培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中進(jìn)行。

表1 AMPK各亞基基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)觀察及免疫熒光染色 倒置相差顯微鏡下觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞呈大致均一的單層扁平細(xì)胞，具有短而粗大的細(xì)胞突起（圖1）。GFAP和S100β細(xì)胞免疫熒光染色顯示，培養(yǎng)細(xì)胞95%以上為免疫熒光染色陽性細(xì)胞（圖2）。

2.2 RT-PCR實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用AMPK各亞基引物對細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR分析，凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，陰性對照沒有出現(xiàn)任何條帶，在正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞中有AMPK α1、α2、β1、γ1及γ2亞基特異性目的條帶的出現(xiàn)，沒有AMPK β2亞基目的條帶的出現(xiàn)。在出現(xiàn)的5種目的條帶中，AMPK α1及γ2亞基目的條帶表達(dá)量相對較少，AMPK α2、β1及γ1亞基目的條帶表達(dá)量相對較多，結(jié)果提示AMPK α2、β1及γ1亞基構(gòu)成的三聚體可能在星形膠質(zhì)細(xì)胞能量代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用（圖3）。

3 討論

AMPK通過調(diào)節(jié)機(jī)體的能量代謝維持機(jī)體能量的供求平衡。星形膠質(zhì)細(xì)胞對維持腦內(nèi)能量代謝的穩(wěn)定起重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR的方法發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中AMPK α2、β1及γ1亞基表達(dá)相對較多，AMPK α1及γ2亞基表達(dá)相對較少，AMPK β2亞基沒有表達(dá)，提示AMPK在星形膠質(zhì)細(xì)胞中形成AMPK α2/β1/γ1三聚體。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量最多的一類細(xì)胞，在神經(jīng)元的發(fā)育分化、修復(fù)再生、信號傳遞、突觸形成和消除、免疫調(diào)免疫調(diào)節(jié)、學(xué)習(xí)記憶和呼吸調(diào)節(jié)等方面具有重要生物學(xué)作用[8]。近年來對星形膠質(zhì)細(xì)胞在各種腦疾病中的作用研究越來越多，尤其是缺血性腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元的保護(hù)作用受到研究者關(guān)注[9-10]，但由于在體研究干擾因素較多，不能區(qū)別是原發(fā)損傷還是繼發(fā)損傷，利用體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行疾病相關(guān)研究受到研究者重視。在本實(shí)驗(yàn)中，我們利用新生大鼠進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，并使用GFAP[11]和S100β[12]進(jìn)行鑒定證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞95%以上為GFAP和S100β免疫熒光染色陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞（200×）

AMPK是1994年由Carling等[13]首次從細(xì)胞內(nèi)提取并進(jìn)行基因測序，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)AMP水平升高或ATP/AMP比率下降時(shí)，AMPK即可被激活，進(jìn)而促進(jìn)糖原分解、糖酵解、脂肪酸氧化等分解代謝來增加ATP的生成，同時(shí)抑制糖原合成、脂肪酸合成等合成代謝，以減少ATP的消耗[14]。研究顯示，缺血性腦損傷后AMPK活化可產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用[5，7，15-16]，但也有研究證實(shí)，腦組織中的AMPK活化是有害的[5，17-18]。AMPK在缺血性腦損傷病理生理學(xué)過程中的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

AMPK是由α、β和γ亞基組成的一種異源三聚體，每種亞基又由不同基因編碼形成不同的亞型。其中α亞基由2種基因編碼形成α1和α2，β亞基同樣由2種基因編碼形成βl和β2，而γ亞基由3種基因編碼形成γ1、γ2和γ3。α亞基作為催化亞基，β和γ亞基是調(diào)節(jié)亞基，γ亞基具有AMP結(jié)合位點(diǎn)，β亞基主要是起連接α和γ亞基的作用。現(xiàn)有研究顯示AMPK各亞基的組織、細(xì)胞和亞細(xì)胞定位以及各亞型的不同組合方式?jīng)Q定了AMPK在不同組織內(nèi)的生物學(xué)作用。有研究顯示除AMPK γ3亞基外，其余各亞基均表達(dá)在腦內(nèi)神經(jīng)元[19]，本實(shí)驗(yàn)利用培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞中有較多AMPK α2、β1及γ1亞基表達(dá)，提示在星形膠質(zhì)細(xì)胞中AMPK由α2、β1及γ1亞基形成三聚體在其能量代謝調(diào)節(jié)中起重要作用。Turnley等[19]利用免疫組化的方法在星形膠質(zhì)細(xì)胞檢測到AMPK α2亞基高表達(dá)，只在神經(jīng)氈發(fā)現(xiàn)少量AMPK α1亞基表達(dá)，這與我們的結(jié)果是相似的。Li等[18]分別利用敲除小鼠AMPK α1和α2基因進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷后只有AMPK α2基因的激活會加重腦組織損傷，AMPK α1基因無此作用。由以上結(jié)果推測，星形膠質(zhì)細(xì)胞上的AMPK α2/β1/γ1三聚體極可能參與缺血性腦損傷的發(fā)生發(fā)展并在其中扮演重要角色。有文獻(xiàn)報(bào)道，AMPK β1亞基主要表達(dá)在腦內(nèi)，對正常腦的發(fā)育是必需的[20]，在本次實(shí)驗(yàn)中我們也檢測到了星形膠質(zhì)細(xì)胞上AMPK β1亞基的高表達(dá)，推測其可能參與腦的發(fā)育。在本次實(shí)驗(yàn)中我們沒有檢測到AMPK β2亞基的表達(dá)，有文獻(xiàn)報(bào)道AMPK β2亞基主要表達(dá)在骨骼肌中[21]。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞上AMPK γ1亞基高表達(dá)，Turnley等[19]在實(shí)驗(yàn)中通過免疫組化的方法沒有在星形膠質(zhì)細(xì)胞中檢測到有AMPK γ1亞基的大量表達(dá)，這可能與實(shí)驗(yàn)條件及檢測方法等有關(guān)。已有的研究顯示AMPK γ3亞基僅在骨骼肌細(xì)胞中可見[22]。由以上結(jié)果推測在星形膠質(zhì)細(xì)胞中由AMPK α2、β1及γ1亞基所形成的三聚體的功能可能比較復(fù)雜，其在腦內(nèi)能量代謝障礙相關(guān)疾病特別是缺血性腦損傷中的作用有待進(jìn)一步研究。

圖2 培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP和S100β免疫熒光染色（200×）

圖3 AMPK各亞基表達(dá)在培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞

總之，本研究發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中有大量AMPK α2、β1及γ1亞基表達(dá)，提示AMPK在星形膠質(zhì)細(xì)胞形成AMPK α2/β1/γ1三聚體在星形膠質(zhì)細(xì)胞能量代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步探討AMPK在缺血性腦損傷發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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【點(diǎn)睛】本研究發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中有大量AMPK α2、β 1及γ 1亞基表達(dá)，提示AMPK在星形膠質(zhì)細(xì)胞形成AMPK α2/β1/γ1三聚體在星形膠質(zhì)細(xì)胞能量代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。