嚙齒類腦卒中動物模型的建立

張昕，秦冬冬，尹勇

腦卒中是指由于急性腦循環障礙所致的局限或全面性腦功能障缺損綜合征，或稱為急性腦血管事件。在腦卒中的患者中，缺血性腦卒中最為常見，約占總數的88%，出血性腦卒中占9%，蛛網膜下腔出血約占3%[1]。據2010年全球疾病負擔研究結果顯示，腦卒中作為一個全球性的健康問題，是影響傷殘調整壽命年第3位的原因[2]，而2015年美國心臟協會發布的數據顯示，腦卒中的致死率已上升至第2位[3]。因腦卒中的高致死率和致殘率，近年腦卒中的病理生理機制及細胞、分子生物學的相關研究成為近年的研究熱點。而嚙齒類腦卒中動物模型因其相對廉價、生命力頑強、腦血管解剖結構和生理與人類相似等特點，被廣泛應用于腦卒中疾病相關的研究中。下面本文將分為缺血性腦卒中動物模型的建立、出血性腦卒中動物模型的建立、自發腦卒中動物模型三部分對嚙齒類動物模型的制備方法進行綜述。

1 缺血性腦卒中動物模型的建立

1.1 栓塞法 大腦中動脈線栓栓塞法(middle cerebral artery occlusion，MCAo)：傳統線栓法：大鼠固定麻醉后，常規備皮消毒，取頸部正中切口，分離頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸外動脈(external carotid artery，ECA)、頸內動脈(internal carotid artery，ICA)，分離結扎并切斷ECA，結扎翼腭動脈(pterygopalatine artery，PPA)，夾閉CCA和ICA，將線栓由ECA殘端插入，經ICA進線約18mm插入MCA入口，形成MCA栓塞模型。在傳統線栓法的基礎上，經過不斷改進，形成改良方案：從CCA插入線栓經ICA至MCA起始處，改良方案無需結扎PPA，局部組織損傷小，操作更為簡單，成功率更高[4]。 大腦中動脈及其分支，是腦梗塞最常累及的顱內血管，其發病率約占70%[5]。因此，選擇小鼠大腦中動脈進行栓塞，能夠更好地模擬人類缺血性腦卒中。大腦中動脈線栓法無需開顱，減輕了對顱骨及顱內組織的損害，線栓阻塞大腦中動脈使梗塞面積相對穩定，可重復性高，且可根據線栓存留的時間不同制作大腦缺血再灌注模型及永久性栓塞模型，是目前應用最廣泛的腦卒中模型的制作方法[6]，被認為是缺血性腦卒中機制研究的金標準[7]。但線栓栓塞法不足的是有致血管破裂導致腦出血形成的可能。

除選用上述使用線栓作為栓子外，還有學者使用其他物質作為栓子進行栓塞，例如：舌下靜脈注入鐵粉模型、左心室注射液體石蠟模型、頸內動脈注入微小栓子等血管內注入外來栓子制備多發腦梗塞模型[8]，以及馮光等[8]將凝血酶注入血管內的方法來制作自體血栓體內急性栓塞性腦梗死模型等。

1.2 頸動脈結扎法 單側頸總動脈結扎法[9]：該方法損傷小，模型成功率高，死亡率低，被廣泛應用于卒中模型的建立。

雙側頸總動脈結扎法：分為兩類：①四血管閉塞法(4-vessel occlusion model，4vo模型)[10]：該模型于1979年首次由Pulsinelli WA等提出，方法是電凝阻斷雙側椎動脈24h后夾閉雙側頸總動脈，根據頸總動脈夾閉時間(10min，20min，30min)不同，制造不同程度全腦缺血再灌注模型，多用于腦缺血再灌注神經損害的研究，但手術難度大，并發癥多，造模成功率低。②二血管阻斷法(2-vessel occlusion model，2vo模型)[11-13]：該模型在1972年被Ekl?f等[11]提出，方法是通過阻斷雙側頸總動脈加動脈放血，造成低血壓而形成全腦缺血模型，亦多用于腦缺血再灌注神經損害的研究。2vo模型與4vo模型相比較，其動物模型存活率更高，但缺點是阻斷雙側頸總動脈僅造成不完全性腦缺血，需在此基礎上形成低血壓方可形成全腦缺血模型[14]。上述兩種雙側頸總動脈結扎法經過后來學者的不斷改進，實驗動脈造模死亡率有所下降，制造模型為全腦缺血模型，多用于全腦缺血再灌注的研究。雙側頸總動脈結扎法形成的腦卒中模型的病理特點類似于人類心臟驟停或心肌梗塞后形成腦卒中的病理特點。

1.3 開顱手術模型 開顱手術模型需切除部分顱骨，分離硬腦膜，暴露大腦中動脈進行手術。閉塞大腦中動脈的手術方式大致分為三類：①開顱大腦中動脈阻斷模型[15-17]：分離腮腺、顳肌，離斷顴弓，切除大腦中動脈上方的顱骨，進行永久性離斷、結扎或電凝大腦中動脈、光化學栓塞、三氯化鐵化學誘導中動脈栓塞、局部內皮素注射誘導栓塞等，建立缺血性腦卒中模型； ②開顱三血管阻斷模型(3-vessel occlusion model，3vo模型)[18]：在上述開顱永久性阻斷一側大腦中動脈的基礎上臨時阻斷雙側頸總動脈，以減少側枝循環的影響，和加強缺血性損傷。③顱骨鉆孔去皮層血管缺血手術模型[19]：麻醉后,剪開顱頂皮膚,暴露顱骨。在顱骨正中線左側用牙科鉆分別鉆6個孔, 用眼科剪沿著6個孔翻開顱骨, 暴露硬腦膜; 用虹膜剪剪開硬腦膜, 暴露軟腦膜，在解剖顯微鏡下用沾生理鹽水的棉簽輕輕擦拭軟腦膜上的血管, 直到鏡下看不到血管為止，形成缺血性腦卒中模型。上述模型的特點是開顱可在直視下操作，成功率較高，但需要開顱，創傷性較大，破壞血腦屏障，引起腦脊液漏，感染幾率增大，成功率與手術技術相關[20]。

1.4 光化學栓塞模型 光化學栓塞法原理是基于血管內光氧化導致血栓形成，使熒光照射區域局灶血管內皮過氧化損傷、血栓形成及腦皮質缺血性損害。具體方法是通過給動物循環系統內或小鼠腹腔內注射一種光敏染料，例如玫瑰紅或赤蘚紅，然后使用特定波長的光束透過顱骨照射選定的區域，激活光敏染料，此過程產生的氧自由基，導致照射區域內軟腦膜及腦實質血管內皮損傷，血小板活化聚集，形成光化學栓塞模型[16, 21]。光化學栓塞法的優點是通過三維立體定位、調整照射光束的波長、照射的時間可制作出病變部位、范圍、程度均一的局灶性缺血性卒中動物模型，可在指定的皮質區發生梗塞，而不限于大腦中動脈供血區，無需開顱，操作簡單，避免手術對實驗動物腦組織、血管的機械性損傷，且對動物全身影響小，有較高的可重復性和較低的死亡率[21-23]。但該模型由于血栓阻塞發生于終末動脈，更近似人類的微血管病變，而不能說明人類其他缺血性腦卒中的發生機制[23]。

1.5 直流電刺激頸總動脈法[24]除上述開顱中動脈電凝法，于2015年由馬寅仲等[24]提出一種新穎電凝方法，該方法使用直流電刺激頸總動脈制造血栓，通過血流引導碎栓堵塞中動脈，制造腦栓塞模型。具體方法是：將大鼠麻醉固定，縱向剪開頸部皮膚，分離頸外動脈、頸總動脈與頸外動脈，夾閉頸外動脈，剝離動脈鞘及神經，將頸總動脈放入血管電擊夾溝槽內進行電擊，可見電擊血管內形成血栓，夾閉頸總動脈遠心端，用軟質鑷子夾動形成血栓的血管處，使血栓與血管壁分離，開放頸總動脈處動脈夾，可見血栓隨血液流動進入頸內動脈后立即夾閉頸總動脈近心端10～15min，到時間后打開全部動脈夾，形成栓塞模型。造模成功率為87.2%。該模型改進了以往需開顱進行電凝的手術方式，無需開顱減少了手術對腦組織的損傷，更為接近心源性栓塞的病理過程，造模成功率較高、梗死面積穩定，造模后能夠表現出相應的神經與運動功能障礙。

2 出血性腦卒中動物模型的建立

2.1 開顱出血性腦卒中模型建立 開顱出血性腦卒中模型是通過直接行手術局部開顱、解剖定位顱骨鉆孔、立體定位等技術打開顱骨，選擇不同物質注入到腦內特定區域制作開顱出血性腦卒中模型。根據注入腦組織物質不同分為下面3類方法：①自體血注入法[25-26]：抽取自體動脈(尾動脈、股動脈、心室腔等)或靜脈血，開顱后向顱內注射血液(注射部位多選用尾狀核進行注射)形成腦出血模型[27]。為減少蛛網膜下腔積血和針道返流，有學者將該方法進一步改進，如低壓注射法、二次注射法、三次注射法、微量泵控制注射法及自體凝固血注射法等，經上述改進，模型的穩定性、重復性均有所改善。該方法的優點是對腦內血腫位置和體積能夠控制，重復性好，但對動物的損傷較大。②膠原酶注入法[25, 28]：該方法是向特定區域腦組織內注射可破壞血管壁的藥物(如膠原酶、膠原酶+肝素、膠原酶+自體血等)造成局部血管壁破裂導致腦出血。該模型的出血量取決于膠原酶的用量，所產生的出血面積、形態、部位重復性較好，但該方法誘導腦出血以滲血為主，與臨床所見腦血管破裂出血有一定差距。③植入惰性物質建立腦出血模[25-26]：通過向腦內植入惰性物質如微氣囊、石蠟油等，產生類似血腫的占位效應。該模型的優點是可人為控制氣囊內的氣體量，能產生一致、可重復的腦損害，避免了自體血注入法中血液進入蛛網膜下腔或破入腦室以及血腫形態不一的缺陷，并可以逐漸放氣，有利于了解占位物質逐漸清除后的效應，但外來異物不能模擬出血后腦組織病理損害及細胞毒性。目前已較少應用。

2.2 非開顱出血性腦卒中模型建立 張昊[28]根據血管內穿刺法制備大鼠蛛網膜下腔出血模型的方法[29]提出穿刺頸動脈制備腦出血模型的理論，該方法通過頸外動脈刺入導絲，應用頭皮導聯腦電圖及局部腦血流量監測進行穿刺定位，因大鼠蛛網膜下腔出血模型制備目前已成熟，運用該方法制備腦出血模型理論上有一定可行性，但該方法尚未應用實踐于實驗中。張昊[28]認為選擇動脈穿刺符合腦出血模型動脈出血的要求，避免穿刺過深損傷腦組織，省去各種方式的采血過程，減少了對大鼠的損害。但本人認為，該方法應用于實驗有一定困難，因行顱外部監測進行定位準確性差，且出血量無法控制，有待進一步研究。

3 自發腦卒中動物模型

改變大鼠基因獲得的易卒中型自發性高血壓大鼠(stroke-prone spontaneously hypertensive rats，SHRSP)和易卒中腎血管性高血壓大鼠(stroke-prone renovascular hypertensive rats， RHRSP)[30]隨著生長時間的延長，可產生自發卒中大鼠模型。但因SHRSP大鼠的遺傳局限性、易變種、斷種和飼養困難的特點在實驗中的應用受到限制，而RHRSP大鼠無遺傳局限性、無需特殊喂養、動物廉價易得、造模技術簡單[31]，而被廣泛應用于動物實驗中。RHRSP大鼠自發卒中率可達56.4%，其中腦出血19.4%，腦梗塞41.9%，蛛網膜下腔出血3.2%，混合性中風35.5%[30]。為進一步增加RHRSP大鼠的自發卒中率，施曉耕等[32]將RHRSP給予大鼠寒冷刺激誘發大鼠發生腦卒中，該方法誘發的腦卒中類型以腦出血為主，發病過程更符合人類高血壓動脈硬化基礎上腦卒中發病的自然狀況，但該模型有卒中類型不能確定、造模成功率低、造模周期較長等缺點。為改進上述不足，有學者在制備RHRSP大鼠后[30]，聯合上述各種制備缺血性或出血性腦卒中的方法，制備RHRSP缺血性或出血性卒中動物模型，以更好地模擬人類高血壓動脈硬化腦卒中模型。

4 小結

上述各種嚙齒類腦卒中動物模型為腦卒中的病理生理機制的研究提供了一種途徑，通過對腦卒中病理生理及損傷機制的研究，可針對性研發相應的預防腦卒中發生及腦卒中后神經保護治療的方法。但嚙齒類動物與人類存在種族差異性，實驗動物多為健康青壯年動物，而腦卒中患者多為中老年人，且腦卒中患者常合并較多疾病如高血壓、糖尿病、高血脂、心臟病等，以及擁有不良生活習慣和口服多種藥物史，在實驗中應綜合考慮上述差異性，使通過動物模型獲得的實驗數據結果同樣適用于人類腦卒中患者。有望能在以后的腦卒中動物模型中建立不同性別、年齡、合并多種共病的標準化腦卒中物模型，統一動物實驗中的處理因素和影響因素，以減少對實驗結果的影響，并通過對實驗設計的不斷改進和創新，更好地模擬人類腦卒中的發病過程，以充分研究和認識腦卒中的病理生理機制，從而服務于臨床疾病的治療。

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