一種乳酸桿菌-玉竹多糖合生元的制備工藝研究

鄧麗娜*，袁 斐

（1．張家港市中醫院，江蘇 蘇州 215600；2．南京中醫藥大學翰林學院，江蘇 泰州 225300）

合生元是有益菌和益生元相結合的生物制劑，合生元具有調節人或動物腸道微生態環境，增強免疫力和消化能力的作用[1]。益生菌在腸道內能夠抑制有害微生物的生長，增強非特異性免疫功能來預防疾病。益生元則可以選擇性地促進定值于腸道內的微生物的生長，調節腸道菌群結構，改善宿主的消化能力，促進宿主健康[2-3]。通常合生元的有兩種類型：配伍型合生元與發酵型合生元。配伍型合生元是將益生菌和益生元按照一定比例配伍制備得到。這種合生元可以保證益生菌和益生元各自的穩定性，但其活性無法得到保證；發酵型合生元是將益生元與益生菌進行體外混合發酵，發酵產物作為合生元飼喂動物。這種合生元可以充分發揮益生菌和益生元各自的特點與優勢，兩者相互促進，協同發揮作用，其效果往往比配伍型合生元要好[4-5]。

近年來，中藥在合生元制備領域表現出較好的研究前景。很多研究者發現中藥中的活性物質，如多糖類、皂苷類、三萜類等成分具有明顯的益生活性，不僅能促進益生菌的生長，同時也能發揮調節腸道微生態的作用[6-7]。玉竹為百合科植物玉竹Polygonatum odoratum （Mill.）Druce的干燥根莖。性微寒，味甘平，歸肺、胃經。具有養陰潤燥，生津止渴之功[8]。現代藥理學研究表明，玉竹中的多糖類成分是其發揮藥理作用的主要有效成分之一。玉竹多糖具有較好的抗氧化、調節免疫、增強動物耐缺氧能力的作用[9-12]。近年來，以中藥多糖類成分作為益生元與乳酸桿菌共同發酵制備合生元的研究越來越多。有學者將黃芪多糖與乳桿菌共發酵制備黃芪多糖合生元，飼養小鼠結果表明，該合生元能顯著提升小鼠免疫能力。

本實驗旨在研究玉竹多糖-乳酸桿菌體外合生發酵的條件進而制備合生元，為玉竹多糖合生元飼料添加劑的開發提供基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

玉竹購于江蘇海昌中藥集團。經南京中醫藥大學陳建偉教授鑒定為百合科植物玉竹Polygonatum odoratum（Mill.）Druce的干燥根莖。樣品采集后進行分揀處理，保存于干燥陰涼處。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉竹多糖的制備

稱取玉竹干燥樣品2.0 kg，按照1:10（m/V）比例加入石油醚脫脂兩次，脫脂后樣品烘干，加入10倍量的80%乙醇，80 ℃水浴回流提取2 h，趁熱濾過，濾渣用熱的80%乙醇，洗滌2～3次，濾渣干燥后，加入10倍量的純水于150℃加熱回流，提取兩次，2 h/次，合并提取液。減壓濃縮水提液至適當體積，緩慢加入無水乙醇，使含醇量達到80%，4℃靜畳過夜，離心，得上清濾液和沉淀，沉淀即為玉竹粗多糖。

稱取粗多糖100 g，溶解于1.0 L純水中，得多糖水溶液。稱取三氯乙酸100 g，溶解于純水中，制成5%三氯乙酸溶液。將粗多糖和三氯乙酸溶液按體積比1:1混勻，4℃靜畳過夜，離心取上清，再加入和上清液同體積的三氯乙酸溶液，進行二次除蛋白。將除完蛋白后的多糖溶液減壓濃縮至一定體積，緩慢加入無水乙醇，使其含醇量達80%，于4℃靜置過夜后，用布氏漏斗抽濾，得到的沉淀即為除去蛋白后的多糖。將該沉淀溶于去離子超純水中，經AB-8型大孔吸附樹脂吸附，進行脫色、除雜處理，冷凍干燥后即得玉竹水溶性多糖（YZP）。

1.2.2 乳桿菌生長曲線及種子液培養時間的確定

無菌操作臺中，用接種環將保存在固體培養基上的乳桿菌挑取出一環到含有100 ml MRS培養基的250 mL錐形瓶中，在30℃、180 r/min的恒溫振蕩器中培養，每隔2 h取樣一次，2 mL/次，菌液于6000 r/min離心后棄去上清液，沉淀加入等體積的蒸餾水混勻，在600 nm下測定其菌懸液的相對吸光度OD值，平行三次。以時間（h）為橫坐標，OD值為縱坐標繪制乳桿菌24 h生長曲線，確定種子液的培養時間。

1.2.3 乳桿菌培養初始pH值的確定

將MRS培養基在滅菌前用1 mol/L的NaOH或HCl調節pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，各培養基按照100 ml的裝液量分別裝入250 mL錐形瓶中，121℃滅菌20 min。無菌操作臺中，用接種環將保存在固體培養基上的乳桿菌接到含有100 mL MRS培養基的250 mL錐形瓶中，按照2.3.3項下篩選出的最佳活化時間培養。然后按2%的接種量分別接種到不同pH值的MRS培養基中，放入30℃的恒溫振蕩器中培養，每隔4 h取樣一次，2 mL/次，菌液于6000 r/min離心后棄去上清液，沉淀加入等體積的蒸餾水混勻，在600 nm下測定其菌懸液的相對吸光度OD值，平行三次。以時間（h）為橫坐標，OD值為縱坐標繪制乳桿菌在不同初始PH值下的生長曲線，優選出最佳培養PH值。

1.2.4 乳桿菌接種量的確定

無菌操作臺中，用接種環將保存在固體培養基上的乳桿菌接種到MRS培養基中活化，然后按照不同接種量（1%、2%、4%、6%）接種到最優pH值的MRS培養基中，放入到30℃的恒溫振蕩器中培養，每隔2 h取樣一次，每次2 ml，菌液于6000 r/min離心后棄去上清液，沉淀加入等體積的蒸餾水混勻，在600 nm分光光度計下測定其菌懸液的相對吸光度OD值，平行三次。以時間（h）為橫坐標，OD值為縱坐標繪制乳桿菌在不同接種量下的生長曲線，優選出最佳接種量。

1.2.5 乳桿菌培養溫度的確定

無菌操作臺中，用接種環將保存在固體培養基上的乳桿菌接到含有100 ml MRS培養基的250 mL錐形瓶中，按照最佳活化時間培養活化，然后按最適的接種量接種到MRS培養基中，分別放入到恒溫振蕩器中，于30℃、34℃、37℃和40℃的條件下振蕩培養（180 r/min），每隔2 h取樣一次，2 mL/次，菌液于6000 r/min離心后棄去上清液，沉淀加入等體積的蒸餾水混勻，在600 nm下測定其菌懸液的相對吸光度OD值，平行三次。以時間（h）為橫坐標，OD值為縱坐標繪制乳桿菌在不同溫度下的生長曲線，篩選出最佳培養溫度。

1.2.6 玉竹多糖最適添加量和最適培養時間的確定

在基礎SDM培養基上分別加入不同比例的YZP，使其濃度分別為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g/L。各培養基按照100 mL的裝液量分別裝入250 mL錐形瓶中，121℃滅菌20 min。按照上述篩選的培養條件接種后放入恒溫振蕩培養箱中培養，每隔4 h取樣一次，2 mL/次，菌液于6000 r/min離心后棄去上清液，沉淀加入等體積的蒸餾水混勻，在600 nm下測定其菌懸液的相對吸光度OD值，平行三次。以時間（h）為橫坐標，OD值為縱坐標繪制乳桿菌的生長曲線，篩選出兩種多糖的最適添加量和最適培養時間。

2 結 果

2.1 乳桿菌生長曲線及種子液培養時間的確定

乳桿菌CICC20261的生長曲線可以看出，在0～8 h之間，乳桿菌生長緩慢，8～12 h之間生長迅速，而在12 h后，生長趨于平緩，此時乳桿菌處于生長的穩定期，此時菌液活菌數高，菌液濃度大。因此，12 h可以作為乳桿菌CICC20261種子液的培養時間。

2.2 乳桿菌在不同PH中的生長曲線

不同pH值下乳桿菌的生長情況可以看出，培養基的初始pH值對乳桿菌的生長影響較大，在pH 3.5～4.5時，乳桿菌的生長受到抑制。同樣，偏堿性的環境對乳桿菌的生長也有抑制，在pH大于7.5時，乳桿菌的生長趨勢明顯小于在pH4.5～7.0之間。通過比較發現，在pH5.0時乳桿菌的生長趨勢最好，因此確定適宜的初始pH值為5.0。

2.3 乳桿菌在不同接種量下的生長趨勢

不同接種量下乳桿菌的生長曲線可以看出，隨著接種量的提高，乳桿菌的在12 h內的OD值是不斷增大的。接種量為4%的OD值與接種量為6%的OD值差異并不明顯，從節省接種量的方面考慮，確定最適宜的接種量為4%。

2.4 乳桿菌在不同溫度下的生長曲線

不同培養溫度下乳桿菌的生長曲線可以看出，在34℃下乳桿菌的生長趨勢最好。因此，選擇34℃為乳桿菌的最適宜培養溫度。

2.5 乳桿菌在不同多糖濃度下的生長曲線

乳桿菌在不同濃度的YZP下的生長曲線可以看出，隨著YZP濃度的增加，在培養的前6 h期間，乳桿菌的生長隨著多糖濃度的增加而增加。培養6h后，乳桿菌的生長趨于平緩。從節省YZP的用量和縮短培養時間的角度考慮，確定YZP的最佳加入量為6.0 g/L，培養時間為10h。

2.6 合生元產品的制備及其活菌數的檢測

把培養好的菌液按1 L菌液：0.5 kg麩皮的比例用干燥細麩皮吸附，在45℃烘箱中烘干即得乳酸菌-玉竹多糖合生元。利用平板計數法對合生元活菌數進行檢測，結果為4×109cfu/g左右。

3 討 論

合生元的效果取決于是否選擇一個好菌種，取決于是否選對與益生菌具有協同作用的益生元。本實驗采用乳酸菌CICC20261及玉竹多糖分別作為益生菌和益生元進行共發酵制備合生元。實驗結果表明玉竹多糖對乳酸菌具有良好的促生長作用，可以用于合生元的發酵制備，是良好的益生元。

為了確定乳酸菌-玉竹多糖合生元的最佳發酵工藝，本實驗通過考察乳桿菌CICC20261的最適生長條件，確定了乳桿菌的最佳活化培養時間為12 h，初始培養基pH值為5.0，接種量為4%，培養溫度為34℃。在此基礎上考察了玉竹多糖的最佳加入量和培養時間，玉竹多糖加入量為6 g/L，培養時間為10 h。最終在優選的培養條件下，制備了玉竹多糖合生元。本試驗將發酵好的菌液以細麩皮作為載體進行吸附后在45℃烘干制成干燥的細粉狀產品，并聞到類似乳酸菌發酵制品典型的味道，符合對益生菌制劑產品的性狀檢測方面的要求。本實驗通過考察玉竹多糖與乳酸菌的共發酵培養條件，確定了發酵培養的最佳工藝，為玉竹多糖合生元的開發提供了科學依據。